Fysisch-chemische eigenschappen van nano-emulsies op basis van lecithine, verkregen door spontane emulsificatie of homogenisatie onder hoge druk

ARTIGO

Fysisch-chemische eigenschappen van nano-emulsies op basis van lecithine, verkregen door spontane emulsificatie of homogenisatie onder hoge druk

Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Nano-emulsies bestaande uit een middellange-keten triglyceride oliekern gestabiliseerd door koolzaad- of zonnebloemlecithines werden bereid door spontane emulgering en homogenisatie onder hoge druk. Deze nano-emulsies werden vergeleken met formuleringen gestabiliseerd met ei-lecithine. De nano-emulsies verkregen door homogenisatie onder hoge druk vertonen een grotere druppelgrootte (230 tot 440 nm) dan die verkregen door spontane emulsificatie (190 tot 310 nm). De zeta-potentialen van de emulsies waren negatief en lager dan -25 mV. Zeta-potentiaal inversie trad op tussen pH 3,0 en 4,0. De resultaten tonen de haalbaarheid aan van de bereiding van lipide-emulsies met koolzaad- of zonnebloemlecithines door spontane emulsificatie en homogenisatie onder hoge druk.

Keywords: nano-emulsie; lecithine; parenteraal; homogenisatie onder hoge druk; spontane emulsificatie.

INLEIDING

Een parenteraal voedingsschema is in principe samengesteld uit macronutriënten (aminozuren, koolhydraten en lipiden) en micronutriënten (vitaminen, elektrolyten en micro-elementen), op voorschrift van een arts, afhankelijk van de toestand, de leeftijd en het gewicht van de patiënt.1 De lipide macronutriënten, toegediend als emulsies, zijn energiedonors, leveranciers van essentiële vetzuren en dragers van vetoplosbare vitaminen. De vetzuren in deze formuleringen zijn van groot metabolisch belang, aangezien zij celmembraancomponenten zijn en een specifieke rol spelen bij hormonale signalisatie en transport. Bovendien zijn ze precursoren van prostaglandinen, leukotriënen, tromboxanen en prostacyclinen, die ontstekingsprocessen, de nierfunctie en de aggregatie van bloedplaatjes moduleren.2 Een tekort aan essentiële vetzuren bij premature kinderen tijdens de ontwikkeling van de hersenen leidt tot leerproblemen en stoornissen van de visuele functie, die onomkeerbaar kunnen zijn, zelfs als later in de ontwikkeling een adequaat vetzuur bevattend dieet wordt verstrekt.2

Parenterale lipidenemulsies zijn heterogene systemen, bestaande uit een oliefase die homogeen gedispergeerd is in een waterige fase (dispergeermiddel), door de aanwezigheid van een emulgator. Een kleine druppelgrootte, gewoonlijk tussen 200 en 500 nm, kenmerkt de formuleringen, wegens het risico van embolie bij gebruik van grotere deeltjes. De emulsies moeten ook een fysiologisch compatibele pH (ongeveer 7), isotoniciteit, lage viscositeit, en een hoog zeta-potentiaal (in modulus) vertonen, om het optreden van instabiliteitsverschijnselen te voorkomen.3

Lipide nano-emulsies worden vaak gebruikt in totale parenterale voedingsadditieven, bekend als 3-in-1 systemen, waarin alle macronutriënten en micronutriënten worden toegevoegd aan een ethylvinylacetaat (EVA) zakje. Deze mengsels ondervinden echter enige fysische instabiliteit door de aanwezigheid van elektrolyten en andere componenten, die kunnen neerslaan of interageren met de emulsiedruppels. Neerslag van calcium en fosfaat wordt in de literatuur op grote schaal gerapporteerd. Bovendien kunnen tweewaardige ionen (zoals calcium en magnesium) de zetapotentiaal van de emulsie verstoren en aggregatie/flocculatie van lipidedruppels induceren, gevolgd door coalescentie. Dit fenomeen is zeer ernstig, want elke druppel met een diameter van meer dan 5 µm die in de bloedbaan terechtkomt, kan een vetembolie veroorzaken.4,5

De fysische kenmerken en de daaruit voortvloeiende stabiliteit van lipide-emulsies hangen sterk samen met hun produktiemethode en samenstelling.3,6 De produktiemethoden zijn divers en kunnen meer dan één stap vereisen om een emulsie met een gereduceerde druppelgrootte te produceren. Een hogesnelheids-homogenisator (Ultraturrax®) kan bijvoorbeeld eerst een grove emulsie creëren. De druppelgrootte kan vervolgens worden verkleind door homogenisatie onder hoge druk, microfluïdisatie of ultrasoonbehandeling.7-9 Een van de methoden die geen voorbehandeling vereisen, is spontane emulsificatie, die vooral wordt gebruikt in formuleringsstudies en gemakkelijk kan worden uitgevoerd op laboratoriumschaal, omdat het niet nodig is om gesofisticeerde apparatuur te gebruiken.10

Tabel 1 toont de samenstelling van typische in de handel verkrijgbare intraveneuze lipide-emulsies. Naast de beschreven componenten moeten de formuleringen voldoen aan de eisen voor injecteerbare producten.11

De oliefase van parenterale emulsies bestaat uit lange-keten triglyceriden (LCT), die gecombineerd kunnen worden met middellange-keten trigylceriden (MCT), zoals weergegeven in tabel 1. LCT bestaan uit een grote verscheidenheid van oliën, zoals zonnebloem-, ricinus-, olijf-, of, meer gebruikelijk, sojaolie. Al deze oliën bevatten vetzuurketens met meer dan 12 koolstofatomen. MCT worden verkregen door verestering van de vetzuren van kokosolie. De emulgatoren bij uitstek voor de stabilisatie van injecteerbare emulsies zijn lecithinen, omdat zij biocompatibel en biologisch afbreekbaar zijn. Lecithinen zijn natuurlijke mengsels van polaire en neutrale fosfolipiden, verkregen uit dierlijke of plantaardige bronnen.12 De fosfolipidensamenstelling van lecithinen uit plantaardige bronnen kan variabel zijn als gevolg van extractie, gewas, en andere verwerkingsomstandigheden.13 Ze bevatten voornamelijk amfotere fosfolipiden, zoals fosfatidylcholine en fosfatidylethanolamine, maar negatieve fosfolipiden kunnen ook aanwezig zijn.

Commercieel verkrijgbare lipidenemulsies voor parenterale voeding zijn meestal samengesteld uit lecithine van eigeel of, zelden, lecithine van soja (Solipid® E&S). Ondanks de talrijke voordelen van vetsuppletie, zijn er meldingen van nadelige klinische effecten gerelateerd aan langdurige suppletie, als gevolg van metabolische beperkingen en immuunreacties bij ernstig zieke patiënten.14,15 Nadelige reacties op parenterale lipidenemulsies worden in verband gebracht met de aanwezigheid van lecithines van sojabonen en eigeel.16-18 Interacties tussen geneesmiddelen en voedingsmiddelenallergieën kunnen leiden tot een reeks bijwerkingen, gaande van gastro-intestinale ontregeling tot anafylaxie.19

In deze context wordt verder gezocht naar alternatieve grondstoffen om hypoallergene vervangingsmiddelen te vinden die veiliger zijn voor parenterale toediening bij patiënten. Dit werk geeft voorrang aan het zoeken naar verschillende lecithines met het doel nieuwe alternatieven te vinden voor lipide-emulsies bestemd voor parenterale voeding, of zelfs als dragers van geneesmiddelen, om de veiligste opties te bieden voor patiënten (vooral premature zuigelingen) met overgevoeligheid voor emulgatoren op basis van eieren of soja. Wij trachtten parenterale lipide-nano-emulsies te ontwikkelen die gestabiliseerd worden door koolzaad- of zonnebloemlecithinen, en vergeleken deze met ei-lecithine-bevattende nano-emulsies. Verder is de bereiding door spontane emulsificatie vergeleken met homogenisatie onder hoge druk, die gewoonlijk wordt gebruikt voor de industriële productie van parenterale lipidenemulsies.

MATERIALEN EN METHODEN

Chemicaliën en reagentia

MCT, sojaolie, en eigeel (Lipoid E80®), koolzaad (Lipoid R100®), en zonnebloem (Lipoid H100®) lecithinen werden verkregen van Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Duitsland), die zo vriendelijk was om de koolzaad en zonnebloem lecithinen te doneren. Glycerol en ethanol werden respectievelijk verkregen van Merck (Brazilië) en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ultrazuiver water werd verkregen uit een Milli-Q®-apparaat (Millipore, Billerica, VS).

Bereiding van nano-emulsies

Lipidenemulsies werden in drievoud bereid volgens twee methoden: spontane emulsificatie en homogenisatie onder hoge druk. De formuleringen verkregen door spontane emulsificatie werden bereid volgens een eerder beschreven procedure.10,20 In het kort, soja-olie werd gemengd met MCT, lecithine, en ethanol. Glycerol werd opgelost in water, waarin de ethanolfase langzaam werd toegevoegd onder matig magnetisch roeren gedurende 30 minuten. Het oplosmiddel werd vervolgens verwijderd door destillatie onder verminderde druk in een roterende verdamper. De door homogenisatie onder hoge druk verkregen formuleringen werden bereid zoals eerder beschreven.21 Eerst werd lecithine gedispergeerd in water dat glycerol bevatte en onder magnetisch roeren bij 40 ºC gemengd, totdat een homogene waterige fase werd verkregen. De oliefase bestond uit sojaolie en MCT. Zowel de olie- als de waterfase werden onder magnetisch roeren gemengd (15 min, bij kamertemperatuur) om een grove emulsie te verkrijgen. De grove emulsies werden vervolgens gemengd bij 9500 rpm gedurende 2 min met een IKA® Ultra-Turrax T8 mixer (IKA® Works Inc., NC, USA) om ruwe pre-emulsies te vormen, die afzonderlijk werden onderworpen aan hogedrukhomogenisatie (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Canada) bij 750 bar (10 000 psi) gedurende 10 cycli om de uiteindelijke emulsie te produceren. De pH-waarde van alle formuleringen werd op 8,0 gebracht met 0,01 mol L-1 NaOH-oplossing. De emulsies werden bewaard bij 4 ºC. De formuleringen en hun bestanddelen zijn vermeld in tabel 2.

Fysisch-chemische karakterisering van de nano-emulsies

De pH-waarden van de formuleringen werden direct na de bereiding in de monsters bepaald met behulp van een geijkte potentiometer (Digimed, São Paulo, Brazilië) bij kamertemperatuur. De gemiddelde druppelgrootte en de polydispersiteitsindex werden gemeten met foton correlatie spectroscopie (PCS) en de zetapotentiaal werd bepaald door elektroforetische mobiliteit, met behulp van een Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, UK) bij 25 ºC. Voor deze metingen werden de nano-emulsies verdund in 1 mmol L-1 NaCl-oplossing in het pH-bereik van 2,0 tot 8,0 eenheden. De viscositeit werd geëvalueerd met behulp van capillaire viscosometrie bij 25 ºC (viscositeitsconstante, k = 0,0212), bij 25 ± 0,1 ºC. De tijd werd geregistreerd, in seconden, die de vloeistof nodig had om van de bovenste naar de onderste markering in een capillair te stromen. Alle formuleringen werden in drievoud geanalyseerd.

Morfologische analyse

Het morfologisch onderzoek werd uitgevoerd met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Een druppel van de nano-emulsie werd op een met koolstof bekleed koperen rooster (200 mesh) geplaatst, negatief gekleurd met een 2,0% uranylacetaat oplossing, en 24 uur laten drogen voor onderzoek. Een JEM-1200 EXII instrument (JEOL, Tokio, Japan), werkend bij 80 kV, werd gebruikt.

RESULTATEN EN DISCUSSIE

In de huidige studie, ontwikkelen we lipide-emulsies bestemd voor parenterale voeding of het dragen van geneesmiddelen, gestabiliseerd door twee lecithines verkregen uit plantaardige bronnen (koolzaad (R) en zonnebloem (S)), als alternatieven voor eigeel lecithine (E), een traditionele stabilisator voor parenterale emulsies. Om de nieuwe formuleringen te vergelijken met de traditionele, werden alle andere emulsiecomponenten in dezelfde concentraties gehouden als die van de commerciële lipide-emulsieproducten. In dit werk worden ook twee verschillende productiemethoden vergeleken: spontane emulsificatie en homogenisatie onder hoge druk.

Tabel 3 geeft de fysisch-chemische eigenschappen van de resulterende nano-emulsies. De door spontane emulsificatie verkregen formuleringen vertonen een gemiddelde druppelgrootte van 220 tot 300 nm, zoals bepaald door PCS. In theorie is dit een gebied met een hoge emulsiestabiliteit.11,22,23 Naarmate de druppelgrootte kleiner wordt, neemt de zelfdiffusiesnelheid toe tot een punt waarop zeer kleine druppels door diffusionele menging kunnen worden tegengehouden.7,23 Nanoemulsies die koolzaad- of zonnebloemlecithine bevatten, vertonen een kleinere gemiddelde druppelgrootte in vergelijking met die welke eigeellecithine bevatten. Vergelijkbare resultaten werden beschreven voor nano-emulsies die volgens dezelfde methode werden verkregen, uitsluitend bestaande uit MCT, als oliefase, en gestabiliseerd met 2% (m/m) ei-lecithine.24 Op basis van deze gegevens zou men kunnen concluderen dat een concentratie van 1,2% voldoende zou zijn om het mengsel van sojaolie, MCT, en water te emulgeren. Hoewel een kleine druppelgrootte en een lage polydispersiteitsindex werden verkregen, bleven de emulsies echter niet fysisch stabiel gedurende meer dan een week na de bereiding, waarna fasescheiding (coalescentie) visueel kon worden waargenomen. Het coalescentieproces is een onomkeerbaar instabiliteitsfenomeen, waarbij oliedruppels hun raakvlakken verliezen en samensmelten tot grotere druppels.25

De kwalitatieve en kwantitatieve samenstelling van nano-emulsies kan, naast het type emulgator en de emulgatiemethode, de druppelgrootte rechtstreeks beïnvloeden.7,23 Daarom werd een tweede methode getest voor de bereiding van nano-emulsies. Hogedrukhomogenisatie wordt in de farmaceutische industrie algemeen gebruikt voor de productie van dergelijke formuleringen, zij het op industriële schaal. Van de verschillende methoden die beschikbaar zijn voor emulsificatie, geniet deze methode de voorkeur wegens de efficiënte druppelverstoring. Dit is een hoogenergetische methode, waarbij groottevermindering wordt bereikt door een grove emulsie onder hoge druk door een homogenisatieklep te persen, waardoor de druppelgrootte wordt vervormd en verkleind.26 Spontane emulsificatie is een goedkope, gemakkelijke en betrouwbare methode, en ze wordt meestal gebruikt in experimentele studies in plaats van een hogedrukhomogenisator, die veel complexer en duurder is.

Zoals blijkt uit tabel 3, produceerde hogedrukhomogenisatie grotere druppelgroottes in nano-emulsies die koolzaad- (296 ± 18 nm) of zonnebloemlecithine (417 ± 25 nm) bevatten, in vergelijking met de vorige methode, en ten opzichte van de controle-ei-lecithine-emulsies (243 ± 12 nm). Niettemin moet erop worden gewezen dat, ook al was de hogedrukhomogenisatie minder efficiënt in het uiteenvallen van de druppels, zij de formuleringen stabieler heeft gemaakt. In tegenstelling tot de emulsies die door spontane emulsificatie werden verkregen, waren deze visueel stabiel gedurende ten minste 30 dagen. Deze resultaten bevestigen het belang van de bereidingswijze voor de stabiliteit van de emulsie.

Voor intraveneuze toepassingen is de grootteverdeling van de lipidedruppels wellicht nog belangrijker dan de gemiddelde druppelgrootte. Een kleine populatie van grote oliedruppels kan voldoende zijn om een vetembolie te veroorzaken bij patiënten.4,5 De druppelgrootteverdelingen van de bereide formuleringen worden voorgesteld in figuur 1.

In figuur 1 worden twee populaties waargenomen in formuleringen samengesteld uit koolzaadlecithine (verkregen door spontane emulsificatie, figuur 1C) en zonnebloemlecithine (verkregen door spontane emulsificatie of door homogenisatie onder hoge druk, figuren 1E en 1F). Het resultaat is dat voor deze formuleringen een polydispersiteitsindex van meer dan 0,20 wordt verkregen.

De stabiliteit van emulsies kan gecorreleerd worden met de samenstelling en de eigenschappen van hun interfaciale film (lecithine), aangezien deze de zeta-potentiaal van de formuleringen en de afstoting tussen druppels bepaalt, wat één van de mechanismen voor emulsiestabilisatie is.27 Lecithine is een heterogeen mengsel van fosfolipiden; De heterogeniteit ervan is uiterst gunstig wegens de vloeibaarheid van de interfaciale film, in vergelijking met die van een zuivere fosfolipide.28 De voornaamste fosfolipiden van lecithinemengsels zijn fosfatidylcholine en fosfatidylethanolamine, die bij fysiologische pH (7,4) ongeladen zijn. Kleinere hoeveelheden zure lipiden, zoals fosfatidylinositol, fosfatidylserine en fosfatidylglycerol, kunnen ook aanwezig zijn. Deze lipiden worden geïoniseerd bij pH 7,0 en veroorzaken een negatieve oppervlaktelading op de emulsiedruppels, wat bijdraagt tot hun stabiliteit. Elke toegevoegde stof die interfereert met deze lading zal waarschijnlijk de stabiliteit van het systeem wijzigen.29 Ook al is de lecithine van parenterale kwaliteit in hoge mate gezuiverd, toch bevat zij nog een kleine hoeveelheid andere fosfolipiden, zoals blijkt uit tabel 4, waarin de samenstelling wordt beschreven van de drie lecithine grondstoffen die in deze studie zijn gebruikt.

Zoals blijkt uit tabel 3, wordt een kleiner zetapotentiaal (modulewaarde) waargenomen voor nano-emulsies die zijn samengesteld uit raapzaad- of zonnebloemlecithine en zijn verkregen door spontane emulsificatie. Er worden echter geen verschillen waargenomen in de zetapotentialen van nano-emulsies die door homogenisatie onder hoge druk zijn verkregen. Deze resultaten wijzen erop dat de belangrijkste factor die het zetapotentieel beïnvloedt, de bereidingsmethode is. Hoewel onze groep beide methoden heeft geoptimaliseerd, moeten de experimentele omstandigheden meestal worden aangepast, rekening houdend met de samenstelling van de formuleringen. Parameters zoals het aantal cycli en de druk kunnen worden gewijzigd om de gewenste fysisch-chemische eigenschappen van de uiteindelijke formuleringen te verkrijgen.30,31

Zeta potentiaal van nano-emulsies hangt ook af van de ionisatie van de emulgator. Een vermindering van de resulterende lading (in modulus) van 40 mV tot minder dan 25 mV kan de flocculatie- en coagulatiesnelheden verhogen.32 Het zetapotentiaal en de gemiddelde druppelgrootte van nano-emulsies samengesteld uit verschillende lecithines en geproduceerd door verschillende emulgatiemethoden werden geëvalueerd in het pH-bereik van 2,0 tot 8,0. De resultaten worden voorgesteld in figuur 2.

De oppervlaktelading van alle formuleringen daalt tot nul tussen pH 3,0 en 4,0, zoals eerder waargenomen voor Intralipid®, een ei-lecithine-gestabiliseerde triglyceride-emulsie.25 De zeta-potentiaal is afhankelijk van de pH, aangezien H+ een potentiaalbepalend ion is op de fosfolipideoppervlakken, met een iso-elektrische pH van 3,1.33 Een verlaging van de pH resulteert in een verlaagde (minder negatieve) zeta-potentiaal en een snellere flocculatiesnelheid.34 De gemiddelde druppelgrootte vertoont een kleine toename bij de pH van de zeta-potentiaalinversie. Uit figuur 3 kan worden geconcludeerd dat de pH van nano-emulsies bij voorkeur hoger dan 7,0 moet zijn, aangezien een plateau wordt bereikt bij die pH-waarde, waar maximale afstoting tussen oliedruppels wordt waargenomen.

Ten slotte werd de morfologie van de oliedruppels van de door homogenisatie onder hoge druk bereide nanomulsies met TEM onderzocht. Figuur 3 onthult homogene en bolvormige deeltjes, waaruit blijkt dat de emulsiedruppels een gemiddelde druppelgrootte in het nanometer bereik hebben. Deze resultaten bevestigen de vorige analyse van de druppelgrootte.

Nano-emulsies zijn lage viscositeitssystemen met Newtoniaans gedrag. Evaluatie van de emulsieviscositeit is van cruciaal belang, aangezien de intraveneuze toediening van emulsies met hoge viscositeit zeer pijnlijk kan zijn voor de patiënt.23,32 Nanoemulsies samengesteld uit verschillende lecithines vertonen gelijkaardige viscositeiten. Zoals verwacht wordt er geen verband waargenomen tussen de gemiddelde druppelgrootte en de viscositeit van nano-emulsies, aangezien alle formuleringen slechts 10 % oliekern bevatten.35 Daarentegen worden er enkele verschillen in viscositeit waargenomen voor formuleringen verkregen door de verschillende bereidingsmethoden: spontane emulsificatie leverde iets visceuzere emulsies op.

Het is de moeite waard te vermelden dat de samenstellingen van de in dit werk bestudeerde nano-emulsies gebaseerd zijn op die van commerciële nano-emulsies die ei-lecithine als emulgator gebruiken. Het gebruik van een andere emulgator kan een optimalisatie van de concentratie en/of de emulgatievoorwaarden vereisen. Commerciële injecteerbare nano-emulsies die zijn samengesteld uit lecithine van sojabonen (Solipid®) vereisen bijvoorbeeld een concentratie van 1,5% van de emulgator. Aanvullende co-emulgatoren worden soms gebruikt om de emulsies te stabiliseren en een geringere polydispersiteit en kleinere druppels te bevorderen. De toepassing ervan is echter beperkt tot lipide-emulsies als dragers van geneesmiddelen, omdat voor dat doel kleine hoeveelheden van de formuleringen worden toegediend: co-emulgatoren worden niet vaak gebruikt in emulsies voor parenterale voeding, wegens de grote hoeveelheden van deze formuleringen die worden toegediend en de veiligheidsproblemen, vooral in het geval van premature zuigelingen. Natriumoleaat wordt gewoonlijk gebruikt voor het stabiliseren van formuleringen van injecteerbare lipide-emulsies,36 die fungeren als een anionische oppervlakte-actieve stof en een oplosbaarheidsmiddel.27

CONCLUSIES

De resultaten tonen de haalbaarheid aan van het bereiden van injecteerbare lipide-emulsies bestaande uit koolzaad- of zonnebloemlecithinen door spontane emulgering en homogenisering onder hoge druk, als alternatieven voor de traditionele ei-lecithine-nano-emulsies voor patiënten die gevoelig zijn voor ei-derivaten. Verdere studies moeten worden uitgevoerd om de emulgatieomstandigheden te optimaliseren om de stabiliteit van de formuleringen op lange termijn te verbeteren.

ACKNOWLEDGEMENTS

De auteurs danken de Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq) voor financiële steun en Lipoid GmbH voor de ter beschikking gestelde materialen.

1. Waitzberg, D. L.; Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica, 1e ed., Atheneu: São Paulo, 2009.

2. Adolph, M.; Clin. Nutr. 2001,20,11.

3. Bruxel, F.; Laux, M.; Wild, L. B.; Fraga, M.; Koester, L. S.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2012,35,1827.

4. Antunes, M.; Guedes, J.; Arq. Bras. Med. 1994,68,303.

5. Trissel, L. A.; Gilbert, D. L.; Martinez, J. F.; Baker, M. B.; Walter, W. V.; Mirtallo, J. M.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1999,23,67.

6. Almeida, M. E.; Teixeira, H. F.; Koester, L. S.; Lat. Am. J. Pharm. 2008,27,780-88.

7. Benita, S.; Levy, M. Y.; J. Pharm. Sci. 1993,82,1069.

8. Robin, O.; Blanchot, V.; Vuillemard, J. C.; Paquin, P.; Lait 1992,72,511.

9. Mbela, T. K. M. N.; Ludwig, A.; Landau, I.; Deharo, E.; Haemers, A.; Int. J. Pharm. 1994,110,89.

10. Bouchemal, K.; Briançon, S.; Perrier, E.; Fessi, H.; Int. J. Pharm. 2004,280,241.

11. Klang, S.; Benita, S. In Submicron emulsions in drug targeting and delivery; Benita, S., ed; Harwood Academic Publishers: Amsterdam, 1998, chap. 5.

12. Szuhaj, B. F.; Sipos, E. F. In Food Emulsifiers: Chemistry, Technology, Functional Properties and Application; Charalambous, G., Doxastakis, G., eds.; Elsevier Science Publishers B. V.: Amsterdam, 1989, chap. 10.

13. Schneider, M. In Lecithins: Sources, Manufacture, & Uses, American Oil Chemists’ Society: Illinois, 1989.

14. Szuhaj, B. F. In Bailey’s Industrial Oil and Fat Products; Shahidi, F., ed.; John Wiley and Sons: New Jersey, 2005, vol. 3, chap. 13.

15. Adan, D.; La Gamma, E. F.; Browne, L. E.; Crit. Care Clin. 1995,11,751.

16. Himaya, D. T.; Griggs, B.; Mittman, R. J.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1981,13,318.

17. Buchman, A. L.; Ament, M. E.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1991,15,345.

18. Kamath, K. R.; Berry A.; Cummins, G.; New Engl. J. Med. 1981,304,360.

19. Wiesner, A. M.; Romanelli, F.; Stratman, R. C.; Smith, K. M.; Orthopedics 2008,31,149.

20. Yu, W.; Tabosa Do Egito, E. S.; Barrat, G.; Fessi, J. P.; Devissaguet, J. P.; Puisieux, F.; Int. J. Pharm. 1993,89,139.

21. Floyd, A. G.; Pharm. Sci. Technol. 1999,2,134.

22. Driscoll, D. F.; Pharm. Res. 2006,23,1959.

23. Constantinides, P. P.; Tustian, A.; Kessler, D. R.; Adv. Drug Deliver. Rev. 2004,56,1243.

24. Martini, E.; Carvalho, E.; Leão, F.; de Oliveira, M. C.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2007,30,930.

25. Washington, C.; Adv. Drug Deliver. Rev. 1996,20(2-3),131.

26. Walstra, P.; Smulders, P. E. A. In Modern Aspects of Emulsion Science; Binks, B. P., ed.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 1998, chap. 12.

27. Lachman, L.; Liberman, H.; Kanig, L. J. Teoria e Prática na indústria farmacêutica; 3e ed., Lea & Febiger: Philadelphia, 2001.

28. Lawrence, M. J.; Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996,1,826.

29. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,66,1.

30. Dias, D. O.; Colombo, M.; Kelmann, R. G.; Souza, T. P. D.; Bassani, V. L.; Teixeira, H. F.; Anal. Chim. Acta 2012,721,79.

31. Fraga, M.; Laux, M.; Zandoná, B.; Santos, G. R.; Giuberti, C. S.; de Oliveira, M. C.; J. Drug Delivery Sci. Technol. 2008,18,398.

32. Jumaa, M.; Müller, B. M.; Int. J. Pharm. 1998,163,81; Roland, I.; Piel, G.; Delattre, L.; Evrard, B.; Int. J. Pharm. 2003,263,85.

33. Davis, S. S.; Galloway, M.; J. Pharm. Pharmacol. 1981,33,88.

34. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,64,67.

35. Silvander, M.; Hellstrom, A.; Warnheim, T.; Claesson, P.; Int. J. Pharm. 2003,252,123.

36. Formariz, T. P.; Sarmento, V. H. V.; Silva-júnior, A. A.; Scarpra, M. V.; Santilli, C. V.; Oliveira, A. G.; Colloids Surf, B 2006,51,54.

Ontvangen 03/02/2014; aanvaard 17/04/2014; gepubliceerd op het web 15/07/2014