Enterococcen

2.4.3.2 Hydrolytische activiteiten van enterococcen

Enterococcen produceren drie typen enzymen die bijdragen aan hun opportunistische pathogeniteit: hyaluronidase, gelatinase en serine protease . Het hyaluronidase, gecodeerd door het chromosomale hyl-gen, breekt het hoofdbestanddeel van de extracellulaire matrix van gastheercellen af, hyaluronzuur, waardoor weefselinvasie en de verspreiding van toxinen worden vergemakkelijkt.

Gelatinase, gecodeerd door het chromosomale gelE-gen, is een zinkmetalloprotease dat actief is op gelatine, maar ook op collageen, caseïne, hemoglobine, β-insuline en andere biologisch actieve peptiden. Dit enzym draagt ook bij aan het proces van biofilmvorming, wat weefselkolonisatie en persistentie op infectieplaatsen kan bevorderen. Het serineprotease, gecodeerd door het gen sprE, dat zich stroomopwaarts van gelE bevindt en samen met laatstgenoemd gen getranscribeerd is, neemt ook deel aan de pathogenese door gastheerweefsels af te breken.

Enterococcen dragen bij tot de ontwikkeling van kaassmaken tijdens het rijpen door hun proteolytische en lipolytische activiteiten en hun vermogen om vluchtige of lange-keten vetzuren, diacetyl, acetoïne en andere vluchtige verbindingen te produceren. Volgens , E. faecium is betrokken bij de ontwikkeling van smaak, aroma, kleur en textuur. Het draagt dus bij tot het algemene sensorische profiel van bepaalde kazen. Deze kwaliteiten maken het ook een flora bij uitstek voor andere gefermenteerde producten zoals groenten of vlees.

Terwijl de proteolytische activiteiten van melkzuurbacteriën goed beschreven zijn in de literatuur over gefermenteerde producten, zijn die van enterococcen minder bekend. Ze zijn eerder laag in zuivelproducten, behalve voor sommige stammen van E. faecalis . Volgens , binnen dit genus, hangt het niveau van proteolytische activiteit af van de soort en van de stam binnen dezelfde soort. De best beschreven proteasen zijn in staat caseïne te hydrolyseren, maar ook β-lactoglobuline en α-lactalbumine . Vele studies tonen aan dat kazen geproduceerd uit melk geïnoculeerd met E. faecalis een hogere proteolytische activiteit hebben dan kazen geproduceerd zonder deze enzymen. Uit onderzoek naar de groei van 24 stammen van E. faecium en 60 stammen van E. faecalis in magere melk bij 37°C blijkt dat de proteolytische activiteiten van E. faecalis veel beter zijn dan die van E. faecium. Deze resultaten worden bevestigd door en door in zuivelproducten en door op enterococcen geïsoleerd uit gepasteuriseerd vloeibaar heel ei en verantwoordelijk voor hun bederf.

De daaropvolgende afbraak van aminozuren wordt geacht een belangrijke invloed te hebben op de ontwikkeling van het aroma van kazen. Proteolytische activiteiten kunnen ook verantwoordelijk zijn voor de vorming van biogene aminen door enterococcen uit de aminozuren die zij (of andere bacteriesoorten) hebben vrijgemaakt. Figuur 2.6 toont de verschillende biogene aminen die in bedorven levensmiddelen kunnen worden gevormd.

Figuur 2.6. Vorming van biogene aminen in voedselmatrices als reactie op microbiologische metabolische activiteiten. De grijze pijlen geven de decarboxyleringsreacties weer die rechtstreeks leiden tot de vorming van biogene aminen, de stippellijnen geven de biogene aminen aan die worden geproduceerd via metabole routes die verschillen van de eenstapsdecarboxyleringsreacties.

(Figuur ontleend aan , aangepast volgens )

Histamine, tyramine, fenylethylamine en cadaverine worden door een eenstapsdecarboxyleringsreactie geproduceerd uit hun respectieve precursors histidine, tyrosine, fenylalanine en lysine. De produktie van deze biogene aminen, gevolgd door hun uitscheiding, vereist (1) actieve transportsystemen van de precursor-aminozuren, (2) decarboxyleringen en (3) amine-uitscheidingssystemen als gevolg van deze decarboxyleringen. Bij het transport is in het algemeen een proteïne betrokken die het precursor-aminozuur uitwisselt met het amine dat het resultaat is van de decarboxylering. Eenmaal in de cel ondergaat het aminozuur een decarboxylering die wordt gekatalyseerd door een specifieke decarboxylase (carboxylasen EC 4.1.1.1.) in aanwezigheid van pyridoxaalfosfaat. De meest bestudeerde decarboxylases zijn histidine decarboxylase (HDC), tyrosine decarboxylase (TDC) en lysine decarboxylase (LDC), respectievelijk gecodeerd door de hdcA, tdcA en cadA genen. Later worden zij georganiseerd in operons met andere genen die betrokken zijn bij andere stadia van het productieproces van biogene aminen, zoals transport en rijping. Over de specificiteit van deze decarboxylasen is lang gediscussieerd en het staat nu vast dat een decarboxylase verschillende substraten kan decarboxyleren. Enterococcus TDC bijvoorbeeld kan fenylalanine en tyrosine decarboxyleren om respectievelijk fenylethylamine en tyramine te produceren . Putrescine, agmatine, spermidine en spermine worden gesynthetiseerd door verschillende routes gekatalyseerd door groepen genen die specifiek kunnen zijn voor de soort of stam omdat ze mogelijk verworven zijn door horizontale overdracht .

Enterococcen worden beschreven als zijnde in staat om decarboxylase activiteiten te veroorzaken die verantwoordelijk zijn voor de productie van biogene amines in gefermenteerde levensmiddelen. Zij worden zelfs erkend als de sterkste tyrosine en fenylalanine decarboxylase activiteiten in de bacteriële wereld . Melkzuurbacteriën in de endogene flora van gefermenteerd vlees, zoals worst, worden erkend als de belangrijkste tyramineproducenten. Kazen en sommige vleesproducten kunnen geschikte substraten zijn voor de productie van 2-fenylethylamine, tyramine, histidine of andere amines. Deze stammen bevatten dan ook genen of operons die coderen voor decarboxylasen of andere enzymen die betrokken zijn bij de synthese van biogene amines of het katabolisme daarvan . Voor vis en zeevruchten wordt de synthese van biogene aminen niet toegeschreven aan enterokokken . Hittebestendige bacteriën zoals enterokokken, de belangrijkste bacteriën die betrokken zijn bij de productie van biogene aminen in zuivelproducten, worden slechts gedeeltelijk geëlimineerd door pasteurisatie, maar hittebehandeling vermindert het gehalte aan biogene aminen. Dit fenomeen kan te wijten zijn aan de vermindering van het besmettingsniveau van het voedsel en/of aan het feit dat een essentiële decarboxyleringscofactor door pasteurisatie is gedenatureerd.

Hoewel melkzuurbacteriën niet erg actief zijn ten opzichte van lipiden, is bekend dat zij bijdragen aan de smaak van kaas, hetzij door omzetting van vetzuren met korte keten in ketonen of gemethyleerde lactonen, hetzij door de vorming van aldehyden als gevolg van de oxidatie van onverzadigde vetzuren en verantwoordelijk voor de ontwikkeling van ranzige geuren en smaken, hetzij door solvatatie van de aromatische verbindingen geproduceerd uit lipiden maar ook uit proteïnen en lactose . Volgens , en , hebben enterokokken esterase-activiteiten die vaak sterker zijn dan die van andere melkzuurbacteriën. Onder de enterokokken zijn deze activiteiten eveneens variabel en uit onderzoek door blijkt dat zij sterker zijn bij E. faecalis dan bij E. faecium. Andere studies tonen aan dat de lipolytische activiteit van enterokokken niet varieert naar gelang van de soort, maar naar gelang van het type kaas waarvan de stam afkomstig is.

Reeds in 1965 werd aangetoond dat E. faecalis en E. faecium stammen esterase-activiteiten tot expressie brachten. toont aan dat enterococcen actiever waren op triglyceriden dan Streptococcus-stammen en dat de hydrolysesnelheid afnam met het toenemen van de koolstofketenlengte van de vrijgekomen vetzuren (tripropionine > tributyrine > tricaprine > tricaprylin). Zij wijzen op het gebrek aan activiteit op trioleïne. tonen aan dat enterokokken een geringe lipolytische activiteit vertonen wanneer zij in een groeimedium met volle melk worden geplaatst. Uit werk van blijkt tributyrinehydrolyse uitgedrukt door E. faecium en E. faecal wordt geïsoleerd uit kaas, maar deze stammen zijn niet actief op melklipiden. tonen aan dat een lipase van E. faecalis ook actiever is op tributyrine dan op tricaproïne, tricaprylin entrioleïne. Het vermogen van enterokokken om melklipiden te hydrolyseren varieert echter sterk van stam tot stam. Sommige stammen vertonen geen lipolytische activiteit, terwijl andere een hoge activiteit vertonen op een breed scala van vetzuren. Uit onderzoek met synthetische substraten (4-nitrofenyl-acyls) blijkt dat E. faecium actief is op vetzuren met een ketenlengte tussen 2 en 18 koolwaterstoffen. In latere studies tonen dezelfde auteurs aan dat een intracellulair esterase van E. faecium in vitro een activiteit ontwikkelt op 4-nitrofenyl-acylen met een ketenlengte tussen 2 en 12 koolwaterstoffen, met een optimum in de aanwezigheid van 4-nitrofenyl-butyraat (C2) . Uit de werkzaamheden blijkt dat de meerderheid van de geteste enterokokkenstammen (90%, N = 129) in staat is homogene triglyceriden met vetzuren met een ketenlengte tussen 4 en 18 koolwaterstoffen te hydrolyseren, waarbij de activiteit afneemt met toenemende ketenlengte van de koolwaterstoffen. Alle geteste stammen (100%) in ditzelfde onderzoek vertonen een activiteit op de synthetische substraten, van 4-nitrofenylacetaat (C2) tot 4-nitrofenylstearaat (C18), waarbij de activiteit eveneens afneemt met een toename van de lengte van de vetzuurkoolstofketen.

Tot de weinige gepubliceerde studies over hydrolytische activiteiten die een rol kunnen spelen bij het bederf van eiproducten, behoren die waarin lipolytische activiteiten worden aangetoond van de stammen E. faecium en met name E. faecalis, geïsoleerd uit bedorven gepasteuriseerde vloeibare hele eiproducten. Uit onderzoek blijkt dat de helft van de Enterococcus-stammen, afkomstig van industrieel eiwit en getest op hun vermogen om een van de hoofdbestanddelen van de drijvende eilanddesserts, de custardcrème, te bederven, ook lipase-activiteiten vertoont.