Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology
On december 19, 2021 by adminSpore coats are comprised of protein, have ordered arrays of protomeric subunits, exhibit self-assembly and have protective properties . Als slapende metabolisch inactieve levensvormen, kunnen sporen voor onbepaalde tijd overleven in een verdroogde toestand, en er is inderdaad gedocumenteerd dat ze miljoenen jaren intact hebben overleefd. De sporen zijn bestand tegen temperaturen tot 90°C en tegen blootstelling aan schadelijke chemicaliën. De meeste (maar niet alle) sporenvormende bacteriën behoren tot twee hoofdgeslachten, Bacillus en Clostridium. In tegenstelling tot Bacillus differentiëren de sporenvormers van Clostridia zich alleen onder anaërobe omstandigheden, waardoor Bacillus het meest geschikt is om te bestuderen.
Bacillus-soorten produceren één enkele spore of endospore (in tegenstelling tot schimmelexospores) binnen de bacteriële cel door een differentiatieproces waarvoor de gecoördineerde werking van honderden ontwikkelingsgenen vereist is. Volgroeide sporen zijn doorgaans 0,8-1,2 μm lang en hebben een sferische of ellipsoïdale vorm (zie figuur 1A). Het enkele bacteriële chromosoom is gecondenseerd in het centrum van de spore, de zogenaamde kern. Lagen van lipidemembraan en gemodificeerd peptidoglycan omgeven de sporenkern, maar de belangrijkste structuur is de sporenmantel. Dit gelamineerde eiwitachtige omhulsel biedt de spore weerstand tegen organische oplosmiddelen en lysozym. In Bacillus subtilis zijn wel 25 verschillende manteleiwitten aanwezig in twee afzonderlijke mantellagen (Figuur 1B), de binnen- en buitenmantel, maar bij andere soorten zijn er aanwijzingen dat de mantel minder complex is en in sommige gevallen slechts uit enkele eiwittypes bestaat. De structuur en assemblage van de sporenmantel wordt nu gebruikt als een modelsysteem om complexe morfogenetische assemblageprocessen te begrijpen, vergelijkbaar met klassieke studies over de assemblage van faag T4. De buitenste, elektronendichte laag van de B. subtilis-mantel bestaat uit 5 belangrijke polypeptiden, CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) en CotF (8 kDa). CotA is een multikoper-oxidase en kan zich in multimeer-vormen (microscopisch waargenomen) ophopen in de sporulatiecellen in sommige mantel-defecte mutanten. Vermoedelijk gaat de oligomerisatie en zelfassemblage van CotA vooraf aan de afzetting op het oppervlak van de sporejas. Er is ook aangetoond dat de CotG- en CotB-eiwitten covalent op elkaar inwerken en bovendien hebben CotG en ook CotC uiterst ongebruikelijke aminozuursequenties met meerdere herhalingen (>13) van 12-13 aminozuren die rijk zijn aan lysines en tyrosines. Bovendien hebben veel van de sporecoateiwitten bij onderzoek met SDS-PAGE ongebruikelijke profielen, d.w.z. multimeervormen en afwijkende molecuulmassa’s. Onlangs is aangetoond dat de sporenmantel in feite flexibel is en kan uitzetten en inkrimpen; deze eigenschap is van cruciaal belang voor de vorming van sporen wanneer de spore uitdroogt en evenzo voor de kieming wanneer de spore opnieuw uitdroogt. Dit aspect van een zelfgeassembleerde structuur is bijzonder interessant en zou in de toekomst een aantal toepassingen kunnen bieden bij de toediening van geneesmiddelen, nanofabricage en oppervlaktecoatings.
Engineering the Bacterial Spore Coat
Een strategie om Bacillus subtilis-sporen zo te ontwikkelen dat heterologe antigenen op het spore-oppervlak worden weergegeven, is onlangs gerapporteerd en wordt geïllustreerd in figuur 2. Een displaysysteem op basis van sporen biedt verscheidene voordelen ten opzichte van systemen die gebaseerd zijn op het gebruik van bacteriecellen, onder meer de robuustheid van de bacteriële spore waardoor opslag in gedroogde vorm mogelijk is, het gemak van de productie, de veiligheid en een technologisch platform dat wordt ondersteund door uitgebreide instrumenten voor genetische manipulatie.
In tegenstelling tot de schat aan informatie die beschikbaar is over hoe genexpressie de differentiatie van een groeiende cel in een slapende spore regelt, is er weinig bekend over de mechanismen van eiwitintegratie in de mantel, de aard van de structurele componenten die het meest uitwendige deel van de mantel vormen en of er verankeringsmotieven zijn. De eerste pogingen om heterologe eiwitten aan het oppervlak van de spore bloot te leggen waren gericht op twee mantelcomponenten, CotB en CotC. In het geval van CotB is bekend dat dit spore-coateiwit zich aan het oppervlak bevindt, terwijl CotC, in verhouding tot andere coateiwitten, een hoge relatieve abundantie heeft. De waarneming dat deze beide mantelcomponenten niet nodig waren voor de vorming van een schijnbaar normale spore, noch voor de kieming ervan, was een bijkomend positief kenmerk bij de keuze van CotB en CotC als potentiële dragereiwitten.
Twee antigenen werden aanvankelijk geselecteerd als modelproteïnen om op het sporenoppervlak aan te brengen: i) het niet-toxische 459 aminozuur tellende C-terminale fragment van het tetanustoxine (TTFC), een goed gekarakteriseerd en zeer immunogeen 51.8 kDa peptide, dat wordt gecodeerd door het tetC-gen van Clostridium tetani; en ii) de 103 aminozuur bevattende B-subeenheid van het hittebestendige toxine van enterotoxigene stammen van Escherichia coli (LTB), een 12 kDa peptide, dat wordt gecodeerd door het eltB-gen.
CotB als transporteiwit
Zoals andere mantelcomponenten is CotB geassocieerd met de buitenste mantellaag op basis van genetisch bewijsmateriaal en pas onlangs heeft een immunocytofluorimetrische analyse uitgevoerd op intacte sporen aangetoond dat CotB toegankelijk is voor CotB-specifieke antilichamen en daarom dat het hoogstwaarschijnlijk blootgesteld is op het sporenoppervlak .
Het structurele CotB-gen, cotB, staat onder de dubbele transcriptionele controle van σK en het DNA-bindende eiwit GerE. Als gevolg daarvan wordt cotB alleen getranscribeerd in het moedercelcompartiment van de sporulerende cel. Eenmaal gesynthetiseerd in het cytoplasma van de moedercel, wordt CotB geassembleerd rond de zich vormende spore op een manier die op één of andere manier afhankelijk is van CotE, CotG en CotH. Daarom ondergaan CotB en het heterologe eiwit dat er uiteindelijk mee wordt gefuseerd, geen celwand-translocatiestap, die typisch is voor displaysystemen in andere bacteriën.
CotB heeft een sterk hydrofiele C-terminale helft die wordt gevormd door drie 27 aminozuur-repeats die rijk zijn aan serine-, lysine- en glutamineresiduen. Serineresten maken meer dan 50% uit van de C-terminale helft van CotB. De lysineresiduen in de CotB-herhalingen zijn voorgesteld als plaatsen van intra- of intermoleculaire cross-linking, naar analogie van de bindweefseleiwitten collageen en elastine. Het CotB-eiwit heeft een afgeleide molecuulmassa van 46 kDa, maar migreert op SDS-PAGE als een polypeptide van 59 kDa. Onlangs is de discrepantie tussen gemeten en afgeleid molecuulgewicht verklaard door aan te tonen dat CotB aanvankelijk wordt gesynthetiseerd als een 46 kDa soort, en omgezet in een 59 kDa homodimer , dat zowel de N- als de C-terminale uiteinden behoudt zoals voorspeld uit de cotB nucleotide sequentie.
De strategie om recombinante B. subtilis-sporen te verkrijgen die CotB-TTFC of CotB-LTB op hun oppervlak tot expressie brengen, was gebaseerd op (i) het gebruik van het cotB-gen en de promotor daarvan voor de constructie van translationele fusies en (ii) chromosomale integratie van de cotB-tetC- en cotB-eltB-genfusies in de coderende sequentie van het niet-essentiële gen amyE (figuur 3A) . Het plaatsen van de fusie-eiwitten onder cotB transcriptionele en translationele signalen zorgde voor een correcte timing van expressie tijdens sporulatie, terwijl de chromosomale integratie de genetische stabiliteit van het construct garandeerde. Wegens het gebrek aan informatie over de assemblage van de CotB-mantel en over de vereisten voor verankeringsmotieven, werden de eerste pogingen ondernomen door het passagiereiwit op de C-terminal, de N-terminal of in het midden van CotB te plaatsen (Fig. 3B).
Wanneer TTFC en LTB werden gefuseerd met het C-terminale uiteinde van CotB, slaagden de chimereiwitten er niet in zich correct te assembleren op het sporenoppervlak (Isticato en Ricca, ongepubliceerd). Dergelijke aanvankelijke mislukkingen werden toegeschreven aan een mogelijke instabiliteit van de constructen, hetzij op DNA-niveau (repetitieve DNA-sequenties) of op eiwitniveau. Om dergelijke problemen te omzeilen werden TTFC en LTB gefuseerd met het C-terminale uiteinde van een CotB-vorm die de drie 27 aminozuur-repeats had geschrapt, CotBΔ105-TTFC (Fig. 3A). In tegenstelling tot de volledige versie, werd het CotBΔ105-TTFC chimeer eiwit correct geassembleerd en blootgesteld op het sporenoppervlak. Een kwantitatieve dot blot toonde aan dat elke recombinante spore een hoeveelheid CotBΔ105-TTFC fusie-eiwit blootlegde gelijk aan 0,00022 pg, waardoor kan worden geconcludeerd dat 1,5 × 103 chimere moleculen aanwezig zijn op het oppervlak van elke recombinante spore
In tegenstelling tot CotBΔ105-TTFC werd CotBΔ105-LTB niet correct geassembleerd. De stam die deze chimera tot expressie bracht, vertoonde een verminderde sporulatie- en kiemefficiëntie en zijn sporen waren niet resistent tegen lysozym. Deze waarnemingen, samen met de SDS-PAGE analyse van de vrijgekomen manteleiwitten, suggereerden dat de aanwezigheid van CotBΔ105-LTB de sporehuidlaag sterk wijzigde. Een in-silico analyse toonde enige homologie aan tussen het chimeerproduct (in het fusiegebied) en LytF, een celwand-geassocieerd endopeptidase dat door B. subtilis wordt geproduceerd tijdens de vegetatieve groei, waardoor de mogelijkheid ontstaat dat het chimeerproduct de juiste vachtvorming kan verstoren door bepaalde vachtcomponenten af te breken (Mauriello en Ricca, gegevens niet weergegeven).
Naast de hierboven beschreven fusie aan het C-terminale uiteinde is het model-passagiereiwit TTFC ook gefuseerd aan het N-terminale uiteinde en in het midden van CotB (Fig. 3B). In beide gevallen werd de CotBΔ105 vorm van CotB gebruikt om de problemen met de C-terminale fusie te vermijden (zie boven). Zowel de N-terminale als de sandwichfusies leverden chimere producten op die zowel kwalitatief als kwantitatief correct in de mantelstructuur waren geassembleerd. Tenminste in het geval van CotB kon toen worden geconcludeerd dat waar het passagiereiwit wordt blootgelegd, het geen invloed heeft op de weergave op het sporenoppervlak.
CotC als transporteiwit
CotC is een 12 kDa, alkali-oplosbare component van de sporejas van B. subtilis, die eerder werd geïdentificeerd door middel van omgekeerde genetica en vervolgens geassocieerd met de buitenste jaslaag op basis van genetisch bewijsmateriaal . CotC werd aanvankelijk beschouwd als een kandidaat-drager omwille van zijn relatieve abundantie in de vacht (Figuur 1B). Samen met CotG en CotD vertegenwoordigt CotC ongeveer 50% van de totale hoeveelheid gesolubstitueerde manteleiwitten. Dergelijke relatief hoge hoeveelheden zouden de assemblage van een aanzienlijk aantal op CotC-gebaseerde chimaeren op de mantel mogelijk kunnen maken, waardoor een efficiënte heterologe weergave wordt verzekerd. De expressie van het cotC-gen staat onder controle van de moedercelspecifieke σ-factor σK en van de transcriptieregulatoren GerE en SpoIIID. Zoals in het geval van CotB wordt ook CotC getranscribeerd in de moedercel en is voor de assemblage ervan op de mantel geen membraantranslocatie vereist. Het primaire product van het cotC-gen is een polypeptide van 66 aminozuren dat zeer rijk is aan tyrosine- (30,3%) en lysineresiduen (28,8%). Onlangs werd echter aangetoond dat CotC wordt geassembleerd in ten minste vier verschillende eiwitvormen, variërend in grootte tussen 12 en 30 kDa . Twee van deze vormen, met molecuulmassa’s van 12 en 21 kDa en die hoogstwaarschijnlijk overeenkomen met respectievelijk een monomere en homodimere vorm van CotC, worden geassembleerd op de zich vormende spore onmiddellijk na hun synthese acht uur na het begin van de sporulatie. De andere twee vormen, 12,5 en 30 kDa, zijn waarschijnlijk de producten van post-translationele modificaties van de twee andere vormen, die direct op het manteloppervlak optreden tijdens de rijping van de sporen. Zowel CotC-TTFC als CotC-LTB genfusies werden verkregen door het klonen van tetC of eltB in frame met het laatste cotC codon onder de transcriptionele en translationele controle van de cotC promotor regio. De genfusie werd vervolgens geïntegreerd in het chromosoom van B. subtilis op de amyE locus door dubbele cross-over recombinatie (Figuur 3A). Deze twee chimere eiwitten werden op de mantel van recombinante sporen geassembleerd zonder grote invloed op de sporenstructuur en/of -functie, aangezien zij identiek bleken aan wild type sporen wat betreft de efficiëntie van sporulatie en kieming en de resistentie-eigenschappen. Western blot, cytofluorimetrische analyse en, voor CotC-TTFC, immunofluorescentiemicroscopie (Figuur 4) toonden aan dat beide op CotC gebaseerde chimaeren werden weergegeven op het oppervlak van de recombinante sporen. Een kwantitatieve bepaling van de blootgestelde recombinante eiwitten op B. subtilis-sporen toonde aan dat ca. 9,7 × 102 en 2,7 × 103 moleculen van respectievelijk CotC-TTFC en CotC-LTB werden geëxtraheerd uit elke spore.
Hoewel CotC overvloediger aanwezig lijkt dan CotB in de mantel, worden vergelijkbare hoeveelheden heterologe eiwitten blootgelegd door de op CotC gebaseerde en de op CotBΔ105 gebaseerde systemen. Dit resultaat was enigszins onverwacht, aangezien CotC veel talrijker blijkt te zijn dan CotB in de mantel. Een mogelijke verklaring komt van de recente bevinding dat het C-terminale uiteinde van CotC niet alleen essentieel is voor de interactie met andere CotC-moleculen maar ook met andere mantelcomponenten (Isticato en Ricca, manuscript in voorbereiding) en toont derhalve aan dat het gebruik van CotC als drager nog moet worden geoptimaliseerd.
Stabiliteit van in sporen gedisplayde proteïnen
Een van de voornaamste redenen om het gebruik van de bacteriële spore als een gunstig displaysysteem voor te stellen, is de goed gedocumenteerde stabiliteit ervan. Sporen kunnen eenvoudig gedurende lange tijd bij kamertemperatuur worden bewaard zonder dat hun resistentie- en stabiliteitseigenschappen verminderen. Dit zou een uiterst nuttige eigenschap zijn voor een verscheidenheid van biotechnologische toepassingen. Als het passagiereiwit bijvoorbeeld een antigeen is, zou de recombinante spore een ideaal hittestabiel oraal vaccin kunnen worden voor gebruik in ontwikkelingslanden, waar hittestabiliteit het meest van belang is door de slechte distributie en opslag.
Hoewel de stabiliteit van sporen goed gedocumenteerd is, is de stabiliteit van heterologe eiwitten die op het spore-oppervlak worden blootgesteld, pas recent onderzocht. Sporen die CotBΔ105-TTFC (zie boven) tot expressie brengen en ouderlijke sporen werden bewaard bij -80°C, -20°C, +4°C en bij kamertemperatuur en getest bij verschillende bewaartijden tot 12 weken. In alle gevallen bleek de hoeveelheid heteroloog eiwit aanwezig op het oppervlak van recombinante sporen identiek tussen vers bereide sporen en die bewaard tot 12 weken (Fig. 5). Deze resultaten, die aangeven dat heterologe eiwitten stabiel kunnen worden blootgesteld aan het oppervlak van recombinante sporen, bevestigen het spore-gebaseerde systeem als een zeer veelbelovende display-benadering die enkele nadelen van andere systemen zou kunnen ondervangen en die toepassingen zou kunnen vinden in een verscheidenheid van uiteenlopende biotechnologische gebieden.
Beproeving van het principe voor orale vaccinatie met Tetanus als modelziekte
Sporen die CotBΔ105-TTFC tot expressie brengen, zijn gebruikt om muizen langs orale weg te immuniseren. Serum IgG en fecaal sIgA toonden duidelijke seroconversie tegen TTFC. Het doseringsschema omvatte drie reeksen van drie doses (1,67 × 1010) gedurende vijf weken en was gebaseerd op schema’s die geoptimaliseerd zijn voor orale immunisaties. De titers van TTFC-specifiek IgG na 33 dagen (>103) suggereerden dat deze op beschermende niveaus waren en muizen die werden uitgedaagd met tetanustoxine dat overeenkwam met 10 LD50 waren volledig beschermd. Van de acht muizen die werden blootgesteld aan een dosis van 20 LD50 overleefden er zeven, hetgeen suggereert dat dit de drempelwaarde voor bescherming was. Een soortgelijke studie werd uitgevoerd met nasale immunisatie met CotB-TTFC-sporen, maar met een lagere dosis en drie immunisaties. Hier waren de TTFC-specifieke IgG-responsen lager, maar vertoonden nog steeds seroconversie. Deze studies tonen aan dat gemanipuleerde sporen die een heteroloog antigeen tot expressie brengen, gebruikt kunnen worden voor beschermende immunisatie. Bovendien, hoewel mucosale responsen niet belangrijk zijn voor bescherming tegen Clostridium tetani (een systemische ziekteverwekker) zijn ze duidelijk wel belangrijk voor mucosale ziekteverwekkers. Verdere studies zullen nodig zijn om de doseringsschema’s te optimaliseren (minder doses en minder sporen), maar deze baanbrekende studies hebben de weg geopend voor ontwikkeling tegen specifieke mucosale pathogenen. Hoewel deze studies bemoedigend zijn en humorale reacties aantonen, is er nog geen duidelijk bewijs dat wijst op cellulaire reacties. Er is echter aangetoond dat sporen zich verspreiden naar de GALT en worden aangetroffen in de Peyer’s Patches (PP) en mesenteriale lymfklieren. Door de geringe grootte van de sporen (1 μm) zouden zij door M-cellen kunnen worden opgenomen en naar de PP worden getransporteerd waar zij een interactie kunnen aangaan met antigeen presenterende cellen. Uit eerste studies is gebleken dat sporen kunnen kiemen en gedurende korte tijd in darmmacrofagen kunnen overleven en in vivo Th 1-cytokines zoals IFN-γ kunnen uitlokken
.
Geef een antwoord