De ubiquitine-proteasoom route: The complexity and myriad functions of proteins death

Onze perceptie van intracellulaire eiwitafbraak is de laatste tien jaar drastisch veranderd. Van een schraperig, ongereguleerd en niet-specifiek “eindpunt”-proces is het duidelijk geworden dat proteolyse van cellulaire eiwitten een uiterst complex, in de tijd gecontroleerd en strak gereguleerd proces is dat een belangrijke rol speelt in een verscheidenheid van basale trajecten tijdens het leven en de dood van de cel. Twee belangrijke proteolytische cascades zijn beschreven. Caspasen zijn betrokken bij de geprogrammeerde celdood (apoptose), terwijl de afbraak van de meeste kortlevende regulerende celproteïnen wordt gemedieerd door de ubiquitine-proteasoomroute. Hiertoe behoren regulatoren van de celcyclus en deling, zoals mitotische en G1-cyclinen en cycline-afhankelijke kinaseremmers, groeiregulatoren zoals c-Fos en c-Jun, tumorsuppressoren zoals p53, oppervlakte-receptoren zoals de groeihormoonreceptor, en ionenkanalen, zoals cystische fibrose transmembraan geleidingsregelaar (CFTR) bijvoorbeeld. Het systeem is ook betrokken bij de selectieve proteolyse van abnormale/gemuteerde eiwitten en bij de verwerking van antigenen van het major histocompatibility complex (MHC) klasse I-restricted. De ontdekking dat het systeem betrokken is bij de afbraak van c-myc en bij de proteolytische activering in twee stappen van NF-κB, bijvoorbeeld, betekende de “intrede” van ubiquitine-gemedieerde afbraak op het gebied van de transcriptieregulering. Via de afbraak van kortlevende en belangrijke regulerende eiwitten blijkt het systeem een belangrijke rol te spelen in een aantal fundamentele cellulaire processen. Hiertoe behoren de regulering van de celcyclus en -deling, betrokkenheid bij de cellulaire respons op stress en op extracellulaire modulatoren, morfogenese van neuronale netwerken, modulatie van receptoren op de celoppervlakte, ionenkanalen en de secretorische route, DNA-reparatie, biogenese van organellen, en regulering van de immuun- en ontstekingsreacties. Recente gegevens wijzen erop dat het systeem ook betrokken is bij apoptose. Met zo’n brede waaier van substraten en processen is het niet verwonderlijk dat afwijkingen in het proces onlangs betrokken zijn geraakt bij de pathogenese van verschillende ziekten, zowel erfelijke als verworven. Hiertoe behoren spierdegeneratie na denervatie of langdurige immobilisatie, bepaalde vormen van de ziekte van Alzheimer, mannelijke steriliteit, en het Angelman syndroom (voor recente overzichten van het ubiquitine systeem, zie refs. 1-4).

De afbraak van een eiwit via de ubiquitine route verloopt in twee discrete en opeenvolgende stappen: (i) covalente binding van meerdere ubiquitinemoleculen aan het eiwitsubstraat, en (ii) afbraak van het beoogde eiwit door het 26S proteasoomcomplex waarbij vrije en herbruikbare ubiquitine vrijkomt. Voor een efficiënte en specifieke verwijdering van een bepaald eiwit op een bepaald tijdstip moeten zowel de ubiquitineconjugatie als de afbraak van de gemerkte substraten strak gereguleerd worden. In een studie die in dit nummer van de Proceedings is gepubliceerd (5), melden Zhang en collega’s de identificatie van een activeringsregio in de α-subeenheid van de proteasoomactivator PA28 (REG). Om deze bevinding in de juiste biochemische en fysiologische context te plaatsen, zullen wij kort ons huidig inzicht in de ubiquitine proteolytische route bespreken. Het systeem (afgebeeld in Fig. 1) bestaat uit verschillende componenten die in onderling overleg werken. Eén daarvan, ubiquitine, een evolutionair geconserveerd eiwit van 76 residuen, wordt in zijn C-terminale Gly geactiveerd tot een hoogenergetisch thiol-ester intermediair, een reactie die gekatalyseerd wordt door het ubiquitine-activerend enzym, E1. Na activering wordt het geactiveerde ubiquitinegedeelte door een van de vele E2-enzymen (ubiquitine-dragereiwitten of ubiquitine-conjugerende enzymen, UBC’s) overgebracht van E1 naar een lid van de ubiquitine-eiwit ligase familie, E3, waaraan het substraateiwit specifiek is gebonden. E3 katalyseert de laatste stap in het conjugatieproces, de covalente binding van ubiquitine aan het substraat. Het eerste ubiquitinegedeelte wordt overgebracht naar de ɛ-NH2-groep van een Lys-residu van het eiwitsubstraat om een isopeptidebinding tot stand te brengen. In opeenvolgende reacties wordt een polyubiquitineketen gesynthetiseerd door processieve overdracht van extra geactiveerde mootjes aan Lys48 van het eerder geconjugeerde ubiquitinemolecuul. De keten dient, hoogstwaarschijnlijk, als herkenningsmarker voor het proteasoom (zie hieronder). Ubiquitine K48R of gemethyleerd ubiquitine (waarin alle vrije aminogroepen chemisch werden gemodificeerd) kunnen geen polyubiquitineketens genereren en dienen als ketenbeëindigers. Bijgevolg remmen zij, wanneer zij in cellen worden overgeëxpresseerd of in celvrije systemen worden ingebracht, de proteolyse. De binding van het substraat aan de E3 is specifiek en impliceert dat E3’s een belangrijke rol spelen in de herkenning en selectie van eiwitten voor conjugatie en daaropvolgende degradatie. De structuur van het systeem blijkt hiërarchisch te zijn: een enkele E1 blijkt de activering van ubiquitine uit te voeren die nodig is voor alle modificaties. Verschillende belangrijke soorten E2-enzymen werden gekarakteriseerd in zoogdiercellen. Het blijkt dat elke E2 kan samenwerken met een of meer E3 enzymen. Hoewel tot dusver slechts relatief weinig E3-enzymen zijn beschreven, blijkt dat de ubiquitineligasen tot een grote, nog steeds groeiende familie van enzymen behoren. Wat de wijze van herkenning van de ligasen betreft, is het, op een paar gevallen na, onwaarschijnlijk dat elke E3 zich op één enkel substraat richt. Het is eerder denkbaar dat verschillende cellulaire eiwitten door een enkel ligase worden herkend via een vergelijkbaar, maar duidelijk niet identiek, structureel motief. Enkele eiwitten kunnen worden herkend via hun vrije en “destabiliserende” N-terminale residu (“N-end regel”; ref. 6). De overgrote meerderheid van cellulaire proteïnen zijn echter geacetyleerd aan hun N-uiteinden of hebben “stabiliserende” amino-uiteinden en worden via andere signalen herkend. Sommige worden herkend via primaire sequenties die zich stroomafwaarts van het N-terminale residu bevinden. Andere zijn doelwit via secundaire, posttranslationele modificatie(s) zoals fosforylering, of na associatie met neveneiwitten zoals oncoproteïnen of moleculaire chaperonen.

Na conjugatie wordt het eiwitgedeelte van het adduct door het proteasoomcomplex afgebroken, waarbij vrij en herbruikbaar ubiquitine vrijkomt (voor recente overzichten over proteasomen, zie refs. 7-10). Hoewel de huidige consensus is dat 26S proteasoom fungeert als de belangrijkste proteolytische arm van het ubiquitine systeem, kan het substraat spectrum van het enzym breder zijn en ook niet-gesubiquitinyleerde eiwitten omvatten. Een goed bestudeerd geval is dat van ornithine decarboxylase (ODC). ODC wordt afgebroken na een niet-covalente associatie met een antizyme dat in het herkenningsproces kan fungeren als een substraat-specifiek ubiquitine-achtig chaperon. Andere substraten, meestal eiwitten uit het endoplasmatisch reticulum (ER), kunnen ook door het proteasoom worden afgebroken zonder voorafgaande ubiquitinylering, hoewel dit nog niet met zekerheid is vastgesteld. Hiertoe behoren bijvoorbeeld verkeerd gevouwen MHC zware keten moleculen (HC’s), het zoogdier 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA (HMG-R), en de Z variant van het α-1-antitrypsine (α1-ATZ) (besproken in ref. 11). Het is nu ook duidelijk dat niet alle ubiquitingeylde eiwitten het doelwit zijn van afbraak door het proteasoom. Dit geldt vooral voor rijpe membraaneiwitten aan het celoppervlak, zoals de groeihormoonreceptor. Voor deze eiwitten vindt de ubiquitine modificatie plaats na binding aan het ligand en is vereist voor hun endocytose en targeting naar het lysosoom (besproken in ref. 12). Afbraak van membraan-geankerde eiwitten door het ubiquitine systeem werpt belangrijke, nog onopgeloste, mechanistische problemen op die meestal te maken hebben met de vraag hoe twee topologisch verschillende gebeurtenissen zoals misvouwing in de ER en degradatie in het cytosol, of ligand binding in het extracellulaire domein en ubiquitinylering op een cytosolische staart van een receptor samenkomen. Voor membraaneiwitten aan het celoppervlak is de rol van de ubiquitinemodificatie een voor de hand liggend probleem: is deze nodig voor endocytose van het gemerkte eiwit of, in een later stadium, voor de specifieke targeting en opname door het lysosoom. Voor ER-eiwitten die door het cytosolische proteasoom worden afgebroken, zijn belangrijke vragen welke mechanismen ten grondslag liggen aan het terughalen van deze eiwitten over het membraan heen terug naar het cytosol. Het transmembraan domein van membraan-geankerde eiwitten is hydrofoob en de verwijdering ervan uit het membraan gaat waarschijnlijk via een gespecialiseerd, energie-afhankelijk, kanaal-gebaseerd transport. Voor lumenale ER eiwitten draait het om de vraag hoe zij weer naar het cytosol worden getransporteerd.

Recent bewijs suggereert dat het principe van ubiquitine modificatie niet beperkt is tot het richten van eiwitten voor degradatie. Het blijkt dat ubiquitine lid is van een grotere familie, en er zijn ook verschillende ubiquitine-achtige eiwitten beschreven. Een interessant geval betreft de targeting in complexe structuren. Men heeft ontdekt dat de lokalisatie van RanGAP1, een Ran GTPase activerend eiwit, aan het nucleaire porie complex eiwit RanBP2, afhankelijk is van een enkele en stabiele covalente modificatie door een 11,5 kDa, 101-residue ubiquitine-achtig eiwit, SUMO-1 (13). De activeringsreactie is vergelijkbaar met die van ubiquitine en omvat E1 en een specifieke E2, UBC9. Posttranslationele covalente modificatie door ubiquitine en ubiquitine-achtige moleculen heeft dus een breed spectrum van functies. Het is betrokken bij de targeting van eiwitten voor degradatie door het proteasoom en het lysosoom, maar heeft ook niet-proteolytische functies.

Het best bestudeerde proteasoomcomplex dat betrokken is bij de degradatie van met ubiquitine gemerkte eiwitten is het 26S proteasoomcomplex. Het is een “duikelaarvormige” symmetrische structuur die bestaat uit een kernkatalytische eenheid, een tonvormig 20S proteasoomcomplex, dat aan beide zijden wordt geflankeerd door regulerende 19S proteasoomcomplexen (19S-20S-19S). De kristalstructuur van het eukaryote (gist) 20S proteasoom is opgelost op 2,4 Å (14). De studie heeft eerdere voorspellingen over de structuur van het complex bevestigd, maar ook enkele onverwachte kenmerken aan het licht gebracht. Het gistcomplex is gerangschikt als een stapeling van vier ringen, die elk zeven verschillende subeenheden bevatten, α1-7β1-7β1-7α1-7. De verschillende α- en β-subeenheden hebben molecuulmassa’s in het bereik van 25-30 kDa. De actieve sites bevinden zich in drie β-subeenheden, β1, β2, en β5, maar niet in α-subeenheden. Topologische analyse van de locatie van de verschillende subeenheden heeft aangetoond dat voor de drie verschillende proteolytische activiteiten, de trypsine-achtige, de chymotrypsine-achtige, en de postglutamyl peptidyl hydrolytische activiteiten, de actieve sites worden gegenereerd door aangrenzende paren van identieke β-type subeenheden die in verschillende β ringen verblijven. Analyse van de actieve site-residuen onthult een nieuw soort proteolytisch mechanisme. De drie β-subeenheden ondergaan autokatalyse tussen het laatste Gly-residu van het pro-peptide en Thr1 van de rijpe subeenheid dat deelneemt aan het autokatalytische proces en een essentieel onderdeel wordt van de katalytische site. De resolutie van de kristalstructuur maakte ook een beter begrip mogelijk van het werkingsmechanisme van de verschillende proteasoomremmers. Thr1 in β1, β2, en β5 bindt de minder-specifieke calpaine I remmer Acetyl-Leu-Norleucinal (ALLN). Lactacystine, een meer specifieke remmer, kan covalent aan β5 gebonden worden, waar het bovendien een hele reeks waterstofbruggen met andere omringende zijketens kan genereren. Mutatie-analyse heeft uitgewezen dat de andere β-subeenheden, met name β4 en β7 die naast β5 en β1 liggen, de activiteit van deze subeenheden beïnvloeden. Ook β6 en β7 worden via specifieke verwerking uit pro-eiwitten gegenereerd. β3 en β4 worden niet verwerkt. Gezien hun mogelijke rol bij het tot stand brengen van intersubunit contacten en stabilisatie van de complexe structuur, lijkt het erop dat de propeptiden essentieel zijn voor de biogenese en stabilisatie van de proteasomale structuur, en dat processing pas na assemblage plaatsvindt. De structuur van het kristal heeft ook aangetoond dat de α-ketens, hoewel katalytisch inactief, een essentiële rol spelen bij het stabiliseren van de twee-ringen structuur van de β-ketens. Zij moeten ook een rol spelen bij de binding van de 19S cap complexen, maar de structuur van de contacten en de mechanismen van binding zullen pas worden opgehelderd wanneer de kristalstructuur van het 26S complex zal zijn opgelost. De kristalstructuur heeft ook een afstand van 28 Å onthuld tussen Thr1-residuen van aangrenzende actieve β-subeenheden. Deze afstand bepaalt waarschijnlijk de lengte van de peptiden die tijdens het proteolytische proces worden gegenereerd (≈8-aa residuen) en verklaart de rol van het proteasoom bij het genereren van antigene peptiden die op klasse I MHC-moleculen worden gepresenteerd. Het bestaan van tussenproducten van variabele lengte suggereert echter een tweede hydrolytische plaats stroomafwaarts van Thr1 (zie hieronder).

Een belangrijk, maar nog niet opgelost, probleem betreft de binnenkomst van eiwitsubstraten en de uitgang van proteolytische producten uit het proteasoom. Het proteasoom van de archaebacterie (Thermoplasma acidophilum) bevat twee ingangsporiën van ≈13 Å aan de twee uiteinden van de cilinder, omgeven door gedefinieerde segmenten van de zeven α-ketens. In een opvallend en nogal verrassend contrast bestaan deze toegangspoorten niet in het eukaryote 20S proteasoom, en toegang tot de inter-β ringen katalytische kamer is niet mogelijk vanaf de uiteinden van het complex. De N-terminale domeinen van α1, α2, α3, α6, en α7 steken naar elkaar toe uit en vullen de ruimte op in verschillende lagen van strak op elkaar inwerkende zijketens. Binnenkomst vanaf de uiteinden zal dus alleen mogelijk zijn na een aanzienlijke herschikking die mogelijk kan plaatsvinden na associatie met het 19S-complex. Een dergelijke herschikking kan ook metabolische energie vereisen die kan worden geleverd door de ATPase-activiteit van verscheidene van de subeenheden van het 19S-complex. Het gistcomplex vertoont enkele smalle zijopeningen, met name op het raakvlak tussen de α- en β-ringen. Deze openingen leiden rechtstreeks naar de actieve sites van Thr1. Ze zijn bekleed met polaire residuen die zich kunnen herschikken tot ≈10 Å openingen waardoor ongevouwen en verlengde eiwitsubstraten kunnen binnendringen.

Regulatie van de activiteit van het 20S proteasoom vindt plaats op verschillende niveaus. Na stimulatie van antigeen-presenterende cellen met interferon γ worden drie constitutieve β-subeenheden, 1, 2, en 5, vervangen door nieuwe en verschillende β-subeenheden, β1i (LMP2), β2i (MECL1), en β5i (LMP7). De nieuwe subeenheden zijn relatief efficiënter in het genereren van antigene peptiden die door de MHC klasse I moleculen en de juiste cytotoxische T-cellen via de T-celreceptoren worden herkend. Een ander type regulatie betreft de vorming van complexen met regulatorische complexen. Het 26S proteasoom wordt gegenereerd na ATP-afhankelijke associatie van het 20S complex met twee 19S complexen. De 19S-complexen zijn samengesteld uit ten minste 18 verschillende eiwitten met een molecuulmassa van 25-110 kDa. Dit complex fungeert als toegangspoort tot de katalytische kern en levert de verschillende regulerende functies die nodig zijn om te zorgen voor selectieve afbraak van met ubiquitine gemerkte substraten. Daartoe behoren bijvoorbeeld een bindingsplaats voor ubiquitineketens, ubiquitinerecyclingactiviteit en verschillende ATPasen, alsmede de mogelijkheid om de verschillende peptidaseactiviteiten van het 20S-complex te stimuleren. Er zijn inderdaad subeenheden geïdentificeerd die dergelijke activiteiten uitvoeren. Van bijzonder belang is de ubiquitine keten bindende subeenheid die zowel bij zoogdieren (S5a) als bij planten (MBP1) is beschreven. Deze subeenheden binden ubiquitinemonomeren; polyubiquitineketens, en in het bijzonder die welke meer dan vier moe¨n bevatten, binden echter met een hogere affiniteit. Onlangs is het gistgen gekloond dat codeert voor de homologe keten, Mcb1. Verrassend genoeg vertonen Δmcb1-deletiemutanten geen groeistoornis en breken zij normaal geübiquitinyleerde eiwitten af, met uitzondering van het lineaire fusie- modeleiwit ubiquitine-Pro-β-Gal. Zij vertonen echter wel een lichte gevoeligheid voor stress, zoals blootstelling aan aminozuuranalogen (15). Een mogelijke verklaring voor deze onverwachte resultaten is dat geübiquitinyleerde eiwitten worden herkend door een extra, nog niet gedefinieerde, proteasomale subeenheid. Een van deze kandidaten is het deubiquitinylerende enzym Doa4, dat ubiquitinegroepen uit proteolytische substraten verwijdert. Een andere mogelijkheid is dat het proteasoom geen ubiquitinegroepen herkent, maar zich net als moleculaire chaperonnes verbindt met slecht gedefinieerde, verkeerd gevouwen motieven in het eiwitsubstraat. Deze motieven ontstaan na “denaturatie” van het eiwit door ubiquitinetagging. Identificatie van de specificiteit van herkenning van het proteasoom en de rol die ubiquitine in dit proces speelt zijn essentieel voor het begrijpen van de werkingsmechanismen van het protease in het bijzonder en het ubiquitinesysteem in het algemeen. Een andere regulerende functie van het 19S proteasoom betreft de polyubiquitineketenbewerking. Het complex bevat een 37-kDa isopeptidase dat enkele ubiquitinegroepen verwijdert van het distale einde van korte poly-ubiquitineketens (16). Aangenomen wordt dat dit isopeptidase betrokken is bij het bewerken en redden van slecht geübiquitinyleerde of langzaam afgebroken eiwitten van afbraak. In dit opzicht verschilt het van Doa4, een ATP-afhankelijk isopeptidase dat geassocieerd is met het proteasoom. De twee enzymen zijn betrokken bij de recycling van ubiquitine en het op peil houden van het vrije ubiquitineniveau in de cel.

Een ander complex dat associeert met het 20S proteasoom en de activiteit daarvan dramatisch verhoogt is PA28 (REG of de 11S regulator; refs. 17 en 18). In tegenstelling tot de associatie met 19S is de complexvorming met PA28 ATP-onafhankelijk. Na associatie verhoogt PA28 de Vmax en verlaagt het de Km van het 20S-complex ten opzichte van een hele reeks verschillende peptiden. Het PA28-20S-PA28-complex is echter inactief ten opzichte van intacte natieve of met ubiquitine geconjugeerde eiwitten. De pure activator is een complex van twee ≈28-kDa subeenheden, PA28α en PA28β, die ≈50% identiek zijn. Immunoprecipitatie met subunit-specifieke antilichamen en chemische crosslinking-experimenten toonden aan dat PA28 een ringvormig hexamer is dat is opgebouwd uit afwisselend α- en β-subeenheden met een stoichiometrie van (αβ)3 (19). Interessant is dat deze subeenheden ook voor 30-40% identiek zijn aan een nucleair eiwit met een tot dusver onbekende functie, het Ki antigeen, dat reageert met sera van patiënten met de auto-immuunziekte systemische lupus erythematosus. Het hexamere complex heeft een ringvormige structuur (Fig. 1) en het omhult het 20S proteasoom complex op één of beide eindplaatjes. De kapstructuur wordt doorkruist door een centraal kanaal met een 20 Å opening aan het uiteinde en een 30 Å opening aan het proteasoom bindende oppervlak (20, 21). De openingen en het kanaal dienen hoogstwaarschijnlijk als onderdeel van de translocatie-machinerie van peptidesubstraten op weg naar de katalytische kamer van het 20S-complex. PA28α kan hexa- of hepta-homultimeren genereren die zich met het 20S-complex associëren en dit activeren, zij het minder efficiënt dan het (αβ)3 heteromultimeer. PA28β daarentegen associeert niet met het 20S-complex en heeft geen stimulerende activiteit. De rol van de β-subeenheden is waarschijnlijk de activiteit van PA28 te moduleren door indirect de activiteit van de α-subeenheden te beïnvloeden of door de affiniteit van het PA28-deeltje met het 20S-proteasoom te modificeren.

PA28α bevat in zijn centrale deel een unieke sequentie, het KEKE-motief dat een hydrofiel domein is dat is samengesteld uit afwisselend positief geladen Lys-residuen en negatief geladen Glu-residuen. Er werd verondersteld dat dit motief, dat niet bestaat in PA28β, de eiwit-eiwitinteractie bevordert tussen de α-subeenheden van het PA28-deeltje en de α-subeenheden van het 20S proteasoom (22). Mutatieanalyse heeft echter uitgewezen dat ΔKEKE PA28α zijn stimulerende activiteit behoudt (23). Binding aan het 20S proteasoom vereist echter een intacte C-terminus van de PA28α en kan de C2 α-subeenheid van het 20S proteasoom impliceren (8). Er werd gesuggereerd dat fosforylering de stimulerende activiteit van PA28α activeert, maar deze wijze van regulering is niet met zekerheid vastgesteld.

Mutatieanalyse van PA28α door Zhang en collega’s (5) bracht verschillende inactiverende mutaties aan het licht in een gedefinieerde lus aan de basis van het molecuul. Sommige van de gemuteerde eiwitten binden zich stevig aan het 20S complex, maar kunnen het niet activeren (5). Binding aan het proteasoom kan dus duidelijk worden gescheiden van de stimulerende activiteit van PA28. Interessant is dat er een grote kloof is in de verdeling van de inactiverende mutaties over aminozuurresiduen 51-122. Deze mutatievrije zone vertegenwoordigt een gebied dat uniek is voor elke subeenheid in het PA28 complex. Het is waarschijnlijk niet betrokken bij de interactie van PA28 met het 20S-complex of bij het stimuleren van diens proteolytische activiteit. Het kan eerder een rol spelen bij de functie van het deeltje in de intacte cel, zoals bij zijn intracellulaire lokalisatie of associatie met andere componenten die zijn specifieke activiteit en interacties bepalen.

Een belangrijk probleem betreft de fysiologische rol van PA28. Beide subeenheden worden duidelijk geïnduceerd door interferon γ, wat een rol suggereert voor het deeltje in de antigeenverwerkingsfunctie van het proteasoom. Overexpressie van PA28α in een muizenfibroblastlijn die het cytomegalovirus pp89-eiwit tot expressie brengt, resulteert in een duidelijke verbetering van de herkenning door pp89-specifieke cytotoxische T-cellen. Op vergelijkbare wijze werd ook de presentatie van een influenza nucleoproteïne versterkt (24). Studies in een celvrij systeem toonden aan dat het PA28-20S-PA28-complex met behulp van een gecoördineerd dubbelcleavagemechanisme grote peptiden (die flankerende sequenties hebben op zowel de N- als de C-terminine) efficiënt kan trimmen tot de precieze antigene epitopen die door het MHC-complex en de juiste cytotoxische T-cel worden herkend (25). Het lijkt er dus op dat PA28 een belangrijke rol speelt bij de verwerking van antigenen voor presentatie op klasse I MHC-moleculen. Omdat het PA28-20S-PA28 proteasoom geen intacte natieve of ubiquitingeylde eiwitten kan verteren, moet het stroomafwaarts van het 19S-20S-19S proteasoom werken dat eiwitten met ubiquitine-tag of grote peptiden afbreekt. Het is ook mogelijk, hoewel dat niet is aangetoond, dat er één asymmetrisch 19S-20S-PA28 proteasoom bestaat dat dit tweestapsproces van proteolyse, aanvankelijk proteolyse tot grote peptiden, en uiteindelijk trimmen kan uitvoeren. De symmetrische of vermoedelijke asymmetrische PA28-bevattende proteasomen kunnen ook betrokken zijn bij de terminale afbraak van peptiden tot vrije aminozuren, een activiteit die niet gekatalyseerd kan worden door het 19S-20S-19S proteasoom (Fig. 1). Het lijkt er dus op dat opheldering van de cellulaire rollen van het PA28 complex zal moeten wachten op verdere experimenten.