Chromatine toegankelijkheid en architectuur

Figuur 3: Chromosoomconformatie technieken. Verschillende stappen van 3C, 4C, 5C, ChIA-PET, en Hi-C.

Chromatine conformatie capture (3C)

3C maakt gebruik van formaldehyde verknoping om de driedimensionale chromatine structuur te vergrendelen op zijn plaats, gevolgd door restrictie-enzymen digestie. Uitgesneden DNA-fragmenten worden vervolgens geanalyseerd door qPCR en sequencing om te bepalen waar ver uit elkaar gelegen DNA-regio’s zijn verbonden. Deze aanpak voor het analyseren van 3D-chromatine structuur en interacties in vivo werd voor het eerst ontwikkeld in 2002 (Dekker et al., 2002), en is sindsdien uitgegroeid tot de basis voor een groot aantal verwante technieken die zijn ontwikkeld om een grotere schaal, doorvoer, of specificiteit te bereiken.

Circularized chromosoom conformatie capture (4C)

4C maakt identificatie van voorheen onbekende DNA-regio’s die interageren met een locus van belang, waardoor 4C ideaal voor het ontdekken van nieuwe interacties binnen een specifieke regio (Dekker et al., 2006).

4C nuttige tips:

• Kies de juiste restrictie-enzymen. Meer frequente cutters (dwz vier bp herkenningsplaatsen) zijn beter voor lokale interacties tussen de regio van belang en nabijgelegen sequenties op hetzelfde chromosoom (van der Werken et al., 2012).
• Optimaliseer cross-linking. Lagere formaldehydeconcentraties bevorderen ongewenste regio-van-belang zelf-ligaties, maar voorkomen ook DNA “haarballen” die restrictie-enzymsnijden belemmeren. Hoge formaldehydeconcentraties verlagen de zelfbinding, maar verhogen de haarballen. Een optimale formaldehydeconcentratie moet worden gekozen voor de specifieke experimentele situatie om deze overwegingen in evenwicht te brengen. 1% formaldehyde behandeling gedurende 10 min is een goed uitgangspunt voor de meeste experimenten (van der Werken et al., 2012).

Carbon copy chromosome conformation capture (5C)

5C genereert een bibliotheek van eventuele ligatieproducten van DNA-gebieden die associëren met de doelloci, die vervolgens worden geanalyseerd door NGS. 5C is ideaal wanneer veel detail over alle interacties in een bepaalde regio nodig is, bijvoorbeeld bij het in kaart brengen van een gedetailleerde interactiematrix van een bepaald chromosoom. Echter, 5C is niet echt genoom-breed, omdat elke 5C primer individueel moet worden ontworpen, dus het is het meest geschikt voor een specifieke regio’s (Dotsie en Dekker, 2007).

5C nuttige tips:

• Selecteer het juiste restrictie-enzym. De keuze van een enzym dat efficiënt werkt onder uw specifieke experimentele omstandigheden is van essentieel belang. Bijvoorbeeld, BamHI wordt niet aanbevolen voor de meeste experimenten als gevolg van inefficiëntie onder 3C omstandigheden (Dotsie et al., 2007).
• Optimaliseer primer ontwerp. 5C gebruikt twee primers: een voorwaartse 5C-primer die stroomopwaarts van de ligatieplaats bindt, en een omgekeerde primer die onmiddellijk stroomafwaarts bindt. De lengte van de primers moet zodanig worden aangepast dat de annealingtemperatuur ongeveer 65 °C bedraagt, zodat de primers precies met hun restrictiefragmenten annealiseren. Zorg ervoor dat 5C-primers worden gesynthetiseerd met een fosfaat aan het 5′-uiteinde voor ligatie.
• Gebruik een controlesjabloon. Dit zal controleren voor verschillen in primer efficiëntie. Een controlebibliotheek die uit het gehele te bestuderen genomische gebied is samengesteld, wordt aanbevolen. Als deze bibliotheek niet wordt opgebouwd, moeten onderzoekers zich ervan bewust zijn dat de interactiefrequenties minder nauwkeurig zouden zijn.

Chromatine-interactieanalyse door gepaarde-end tagsequencing (ChIA-PET)

ChIA-PET neemt aspecten van ChIP en 3C om de wisselwerking van verafgelegen DNA-gebieden door een bepaald eiwit te analyseren.

ChIA-PET wordt het best gebruikt voor ontdekkingsexperimenten waarbij een eiwit van belang en onbekende DNA-bindende doelen betrokken zijn. Transcriptiefactor bindingsplaatsen, bijvoorbeeld, zijn het best bestudeerd met ChIA-PET, omdat deze techniek vereist dat het DNA te worden gebonden door de transcriptiefactor in vivo voor de interactie te noemen (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET nuttige hints:

• Overlap PET tags om achtergrond te verminderen. Zoals bij de meeste 3C-technologieën is achtergrondruis een technische uitdaging. In ChIA-PET in het bijzonder, kan ruis het moeilijk maken om lange-afstand interacties met de locus van belang te vinden. Een nuttige tip om dit te ondervangen is te eisen dat PET’s aan beide uiteinden van het gebied overlappen om een interactie over lange afstand te zijn.

ChIP-loop

ChIP-loop is een mix van ChIP en 3C waarbij antilichamen worden gebruikt die zijn gericht op eiwitten waarvan wordt vermoed dat ze zich binden aan een DNA-gebied van interesse. ChIP-loop is ideaal om na te gaan of twee bekende DNA-gebieden op elkaar inwerken via een eiwit van belang. ChIP-loop is ook zeer geschikt voor de bevestiging van vermoedelijke interacties, maar niet de ontdekking van nieuwe degenen (Horike et al., 2005).

ChIP-loop nuttige hints:

• Vermijd niet-native lussen. Het grootste probleem dat zich voordoet met ChIP-loop is de vorming van niet-natieve lussen die zich vormen tijdens de DNA-concentratie voordat ligatie optreedt. Een eenvoudige manier om dit te voorkomen is het kiezen van een protocol dat de neerslag uitvoert na de ligatie stap (Simons et al., 2007).
• Valideer ChIP-lus interacties. Een andere uitdaging in ChIP-loop kan zijn nauwkeurige kwantificering van ligatieproducten. 3C technologieën, met name ChIP-loop, vaak vastleggen willekeurige interacties. Om dit te bestrijden, overweeg het uitvoeren van een ChIP-experiment in parallel en het gebruik ervan om de ChIP-loop interacties te valideren. Als een door ChIP-loop geïdentificeerde DNA-eiwit-DNA-interactie inderdaad echt is, dan moeten beide DNA-eiwitinteracties ook in de ChIP-gegevens verschijnen (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplificeert ligatieproducten uit het volledige genoom en beoordeelt hun frequenties door middel van high-throughput sequencing. Hi-C is een goede keuze wanneer brede dekking van het gehele genoom nodig is, en de resolutie is niet van groot belang, het in kaart brengen van de genoom-brede veranderingen in chromosoom structuur in tumorcellen (Lieberman-Aiden et al., 2009), bijvoorbeeld.

Hi-C nuttige hints:

• Optimaliseer bibliotheek amplificatie. Hi-C bibliotheek amplificatie moet genereren genoeg product voor analyse, terwijl het vermijden van PCR artefacten. Om dit te doen, moet het aantal PCR-cycli worden geoptimaliseerd (in het bereik van 9-15 cycli). Als er niet genoeg product kan worden geproduceerd (50 ng DNA), moeten meerdere PCR-reacties worden gepoold in plaats van het aantal cycli te verhogen, vijf reacties zijn meestal voldoende (Belton et al., 2012).
• Balanceer leeslengtes. Zoals bij elke sequentie experiment, van hoge kwaliteit gelezen zijn van het grootste belang. De leeslengte moet optimaal zijn om de behoefte aan lange leest om interacties in kaart te brengen in evenwicht te brengen, maar niet te lang als door de ligatie kruising in de partner fragment. Daarom 50 bp leest optimaal zijn in de meeste gevallen (Belton et al., 2012).
• Kies een geschikte bin grootte. Dit is van cruciaal belang voor de data-analyse. Bin grootte moet omgekeerd evenredig zijn met het aantal verwachte interacties in een regio. Gebruik kleinere bins voor meer frequente intra-chromosomale interacties en grotere bins voor minder frequente inter-chromosomale interacties (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C maakt gebruik van een combinatie van 3C en oligonucleotide capture-technologie (OCT), samen met high-throughput sequencing om honderden loci in één keer te bestuderen. Capture-C is ideaal wanneer zowel een hoge resolutie als een genoomwijde schaal vereist zijn. Bijvoorbeeld het analyseren van het functionele effect van elke ziekte-geassocieerde SNP in het genoom op de lokale chromatinestructuur (Hughes et al., 2014).

Capture-C nuttige hints:

• Kies zorgvuldig sondeposities. Het is het beste om sondes dicht bij de restrictie-enzym sites te plaatsen, zelfs overlappend wanneer mogelijk (Hughes et al., 2014).
• Houd bibliotheken complex. Het behoud van de bibliotheek complexiteit is de hoogste prioriteit. Een complexe bibliotheek betekent meer hoogwaardige interacties in de output. Om deze reden moet alles wat de bibliotheek complexiteit kan verminderen worden vermeden, zoals een Hi-C biotine capture (Hughes et al., 2014).
• Kijk uit voor valse interactie in gedupliceerde regio’s. Het mapping proces kan sterke interacties tussen deze regio’s stimuleren (zoals pseudogenen) die eigenlijk artefacten zijn (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y en Dekker J (2012). Hi-C: een uitgebreide techniek om de conformatie van genomen vast te leggen. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M and Kleckner N (2002). Vastleggen van chromosoomconformatie. Science, 295, 1306-1311.

Dekker J. (2006). The three ‘C’ s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods, 3, 17-21.

Dostie J en Dekker J (2007). Mapping networks of physical interactions between genomic elements using 5C technology. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y and Dekker J (2007). Chromosome conformation capture carbon copy technology. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 21, Unit 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF and Kohwi-Shigematsu T (2005). Verlies van silent-chromatin looping en verminderde inprenting van DLX5 bij het Rett syndroom. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (augustus 2014). E-mail interview.

Hughes JR, et al. (2014). Analyse van honderden cis-regulatoire landschappen op hoge resolutie in een enkel, high-throughput experiment. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J and de Laat W (2007). An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat Methods, 11, 895-901.

van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E and de Laat W (2012). 4C technologie: protocollen en data-analyse. Methods Enzymol, 513, 89-112