Apoenzym

5.11.3 Rol van het eiwit-Interacties tussen enzym, co-enzym, en substraat

In alle gevallen wordt het co-enzym aan het apoenzym gebonden zonder dat het absorptiespectrum ingrijpend verandert. Deze waarneming suggereert dat het enzym de corrine ring niet vervormt ten opzichte van zijn oplossingsconformatie in de grondtoestand. Uit het UV-zichtbare absorptiespectrum van het co-enzym-eiwitcomplex is echter geen informatie beschikbaar over de identiteit van het α-axiale ligand. Studies hebben aangetoond dat het α-axiale 5,6-dimethylbenzimidazool ligand wordt vervangen door een histidine zijketen van het desbetreffende eiwit in ten minste drie cobalamine-afhankelijke enzymen: methionine synthase,4,7 methylmalonyl-CoA mutase,8,45,46 en glutamaat mutase.47 Daarentegen neemt het 5,6-benzimidazool ligand van cobalamine nog steeds de α-axiale ligandpositie in AdoCbl in, gebonden aan diol dehydrase48 en ribonucleotide reductase (zie hoofdstuk 5.08).

Om coördinatie door de histidine zijketen mogelijk te maken, moeten de “nucleotide lus” van de 5,6-dimethylbenzimidazool basis, de ribofuranosylfosfodiester, en de propionamide zijketen wegdraaien van de corrine ring en invoegen in een bindingszak binnen het eiwit. De consensussequentie DxHxxG is geïdentificeerd in cobalamine-afhankelijke enzymen die een histidine zijketen vervangen voor het α-axiale ligand.7,49,50 Het histidine dat coördineert met het kobaltatoom interageert zeer zeker met het aspartaat residu via een waterstofbrug. Behalve de rol van coördinerend ligand, is de precieze functie van de His/Asp dyade als modulator van de enzymactiviteit nog niet duidelijk.49 Andere residuen in de actieve site kunnen ook deelnemen aan een uitgebreid waterstofbruggennetwerk om de reactiviteit in het metaalcentrum te controleren.7

Adenosylcobalamine-afhankelijke enzymen moeten de snelheid van CoC bindingshomolyse met minstens een factor 1012 verhogen om de waargenomen snelheid van katalyse te bereiken.14 Labilisatie van adenosylcobalamine vereist verzwakking van de CoC binding om homolytische splijting mogelijk te maken. Hoewel het geen bewezen concept is in cobalamine-afhankelijke enzymen, zou voldoende energie om de CoC binding te vervormen (verzwakken) gemakkelijk kunnen komen van het gebruik van overtollige bindingsenergie die afkomstig is van meerdere waterstofbruginteracties met de cobalamine cofactor, inclusief de amide zijketens die de corrin ring versieren.51 De amide zijketens zijn ook belangrijke herkenningselementen voor binding aan de niet-enzymatische cobalamine transport eiwitten transcobalamine, haptocorrine, en intrinsieke factor.52 Verwijdering of chemische derivatisering van specifieke amide zijketens verandert de binding aan transcobalamine met een factor 3-4052 en volledige verwijdering van de c-amide zijketen maakt de introductie van een extra dubbele binding in het macrocyclische skelet mogelijk, waardoor de corrine ring wordt afgevlakt met een bijbehorende rode verschuiving van het absorptiemaximum.53

Naast het bevorderen van de gewenste reactie vervullen adenosylcobalamine-afhankelijke enzymen een tweede belangrijke functie door de ongewenste nevenreacties te voorkomen die vaak gepaard gaan met radicale reacties.54 Deze functie van negatieve katalyse54 vereist een sterk begrensd vrij-energie-oppervlak dat kan worden voorgesteld als een diepe canyon waardoor de reactie langs het vrije-energie-oppervlak voortschrijdt. Dit ravijn moet steile wanden hebben om nevenreacties te voorkomen en het zeer reactieve radicale tussenproduct in te dammen. Aan het eind van de reactiesequentie wordt het radicale tussenproduct gedoofd door recombinatie van het 5′-deoxyadenosylradicaal en cob(II)alamine, waardoor de grondtoestand (rusttoestand) van de adenosylcob(III)alamine cofactor wordt geregenereerd. Als het enzym 25 kcal mol-1 investeert om de homolyse van de C-Co binding te bevorderen om de katalytische cyclus te beginnen, moet deze energie aan het eind van de reactiesequentie worden teruggewonnen. Terugwinning van de energie zou niet mogelijk zijn als een ongewenste opeenvolging van herschikkingen zou optreden om een radicaal te produceren dat thermodynamisch stabieler is dan het 5′-deoxyadenosylradicaal. Daarom moet het enzym voorkomen dat het alkylradicaal herschikt tot een intermediair met lage energie, of door de eiwitscaffold migreert om een stabiel radicaal te vormen dat niet aan de katalyse kan deelnemen.55

Een paramagnetische soort wordt pas gevormd wanneer alle reactiecomponenten in het enzym-substraatcomplex aanwezig zijn, omdat de vorming van een van co-enzym afgeleid radicaal in afwezigheid van substraat tot ongewenste nevenreacties zou kunnen leiden. EPR-experimenten met methylmalonyl-CoA mutase46,55 bevestigen dat homolyse van de CoC binding pas optreedt na toevoeging van substraat, zoals blijkt uit het verschijnen van een productachtig EPR-signaal.46 Evenzo blijkt uit stop-flow spectrofotometrische experimenten met ethanolamine ammonia lyase dat de signatuur van cob(II)alamine pas in het zichtbare spectrum verschijnt nadat enzym en co-enzym gecombineerd zijn met verzadigende hoeveelheden substraat.56-59

Fotolyse, thermolyse en enzym-gestuurde homolyse van de CoC binding van adeno- sylcobalamine resulteert in het singlet radicaalpaar bestaande uit cob(II)alamine en het 5′-deoxyadenosylradicaal.60,61 Aangezien al deze processen leiden tot de vorming van hetzelfde radicaalpaar, kan informatie uit de reactiedynamica van fotolyse studies in verband worden gebracht met voorgestelde enzymatische reactiemechanismen. Fotohomolyse van adenosylcobalamine begint met een elektronische π → π* promotie in de corrine ring en moet een intermediaire lading-overdracht toestand betrekken op weg naar CoC binding homolyse.60,61 Picoseconde fotolysestudies van adenosylcobalamine laten geminineerde radicaalpaarrecombinatiesnelheden zien van 109 s-1, met fractionele kooirecombinatie-efficiënties, Fc, van ongeveer 94%.42,62-64 Nanoseconde en continue-golf fotolysestudies van cobalaminen bevestigen efficiënte radicaalpaarrecombinatie in de geminaatkooi, met een totale fotochemische quantumopbrengst van ongeveer 20% voor adenosylcobalamine en 35% voor methylcobalamine.65,66 In afwezigheid van een enzym recombineert een groot deel van de geminineerde radicaalparen voordat er een significante diffusiescheiding optreedt. Om het 5′-deoxyadenosylradicaal te stabiliseren en de katalyse te bevorderen, moet het enzym de afstand tussen de radicaalparen vergroten, waarschijnlijk door een conformatieverandering. Wat het mechanisme ook is, de hoge snelheid van geminate recombinatie in het radicaalpaar vereist dat een van de functies van het enzym is om de radicalen te scheiden of tijdelijk een van de radicalen op te sluiten om voortijdige recombinatie te voorkomen.

Hoewel de resulterende singlet {5′-deoxyadenosylradicaal:cob(II)alamine} radicaalparen identieke elektronische toestanden hebben,59-61,67 kan enzymatische homolyse van de CoC binding geen toegang krijgen tot een aangeslagen elektronische toestand en moet het beginnen met een ander proces om de CoC binding te verzwakken en het evenwicht te verplaatsen in de richting van dissociatie (zie paragraaf 5.11.2). Spanning-geïnduceerde splitsing zal niet alleen resulteren in homolyse van de CoC binding, maar dit proces zal ook de radicaalpaar scheidingsafstand vergroten als een component van de vervorming optreedt langs de apicale kobaltas. Deze brute-force benadering van het uitrekken van de CoC binding kan de meest efficiënte methode zijn om zowel homolyse als een netto afname van de snelheid van radicaalpaarrecombinatie te bereiken.

Het is ook mogelijk voor het enzym om de CoC binding te versterken en homolyse te ontmoedigen door de apicale Co-α-N interactie te comprimeren. De thermodynamische eigenschappen van adenosylcobinamide-analogen + en + werden bestudeerd.68 In + werd een sterkere CoC-binding waargenomen met een kortere CoN-bindingsafstand in vergelijking met pyridine als de α-axiale base. De sterkere CoC binding leidt tot een significante verschuiving naar heterolyse als de voorkeursroute. In dit modelsysteem moet het bestudeerde enzym, methylmalonyl-CoA mutase, ofwel CoC heterolyse voorkomen ofwel een heterolytische route volgen.68

In methioninesynthase zit het corrinegedeelte van cobalamine ingeklemd tussen twee domeinen van een 27 kDa fragment, waarbij de nucleotidestaart doordringt in een diepe pocket die gevormd wordt door residuen van het C-terminale domein.7,69,70 Deze sequentie bevat een regio van matige hydrofobiciteit die wordt geflankeerd door verlengde hydrofiele segmenten.71 Structurele overeenkomsten worden verwacht tussen de domeinen die interfacen met de corrin ring. Het α/β-domein dat de onderste helft van de corrin-ring bindt en plaats biedt aan de verlengde nucleotidenstaart (fosfodiëstermoeder en 5,6-dimethylbenzimidazolgroep) in methioninesynthase en methylmalonyl-CoA-mutase wordt ook verwacht in glutamaatmutase (vide infra).