Alkalisch fosfatase-isoenzym

Genomische structuur, eiwitchemie en enzymologie van alkalisch fosfatase

ALP (orthofosforzuur-monoester fosfohydrolase, alkalisch optimum, EC 3.1.3.1) komt overal in de natuur voor bij planten en dieren (McComb et al., 1979). Bij de mens worden vier ALP-isoenzymen gecodeerd door vier afzonderlijke genen (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Drie van de isoenzymen hebben een wezenlijk weefselspecifieke expressie en worden aangeduid als intestinaal, placentaal, en kiemcel (placenta-achtig) ALP. Het vierde ALP-isoenzym komt ubiquitair tot expressie en wordt daarom TNSALP genoemd (Stigbrand en Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). Skeletweefsel, leverweefsel en nierweefsel zijn bijzonder rijk aan TNSALP. De onderscheidende fysisch-chemische eigenschappen (hittestabiliteit, elektroforetische mobiliteit, enz.) van ALPs gezuiverd uit menselijk bot, lever en nieren gaan verloren bij blootstelling aan glycosidases (Moss en Whitaker, 1985), en TNSALP is daarom een familie van “secundaire” isoenzymen (ik zal ze “isovormen” noemen). Zij worden gecodeerd door hetzelfde gen, hebben dezelfde polypeptidevolgorde, en verschillen alleen door posttranslationele modificaties waarbij koolhydraten betrokken zijn (Harris, 1980).

Het gen mapping symbool voor TNSALP is ALPL (“ALP-liver”), hoewel de functie van de lever-isovorm van TNSALP niet bekend is (zie later). ALPL bevindt zich dicht bij het uiteinde van de korte arm van chromosoom 1 (1p36.1-p34), terwijl de genen voor de intestinale, placentale en kiemcel-ALPs zich aan het uiteinde van de lange arm van chromosoom 2 (2q34-q37) bevinden (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL lijkt het voorouderlijke gen te vertegenwoordigen, terwijl de weefselspecifieke ALPs waarschijnlijk werden gevormd door genduplicatie (Harris, 1990). ALPL is iets groter dan 50 kb en bevat 12 exonen, waarvan er 11 worden vertaald om het rijpe enzym te vormen dat bestaat uit 507 aminozuurresiduen (Weiss et al., 1988b). TATA- en Sp1-sequenties kunnen regulerende elementen zijn, maar de basale expressie lijkt een afspiegeling te zijn van “huishoudelijke” promotereffecten, terwijl de differentiële expressie in diverse weefsels mogelijk wordt gemedieerd door een posttranscriptioneel mechanisme (Kiledjian en Kadesch, 1990). ALPL heeft twee promotors en twee corresponderende 5′-niet-coderende exonen, 1a en 1b. Hun expressie resulteert in twee verschillende mRNA’s met verschillende 5′-onvertaalde regio’s (Nosjean et al., 1997). Transcriptie vindt bij voorkeur plaats vanuit de upstream promoter (1a) in osteoblasten en vanuit de downstream promoter (1b) in de lever en nieren (Millán, 2006).

De weefselspecifieke ALP-genen zijn kleiner dan ALPL, voornamelijk als gevolg van kortere intronen. Aminozuursequenties afgeleid uit hun cDNA’s suggereren 87% positionele identiteit tussen placenta en intestinaal ALP, maar slechts 50%-60% identiteit tussen de weefselspecifieke ALP’s en TNSALP (Harris, 1990).

De aminozuurresidusequentie van TNSALP geeft vijf potentiële N-gekoppelde glycosyleringsplaatsen aan (Weiss et al., 1988). N-glycosylering is noodzakelijk voor katalytische activiteit. O-glycosylering kenmerkt de bot, maar niet de lever, isovorm (Nosjean et al., 1997).

In 2000 werd de kristalstructuur voor humaan placentaal ALP afgebakend met een resolutie van 1,8 A (Le Due et al., 2000). De actieve plaats van TNSALP zou afkomstig zijn van een nucleotide-sequentie die geconserveerd is in ALP’s in de hele natuur (Henthorn en Whyte, 1992), weerspiegelt zes exonen, en bestaat uit 15 aminozuurresiduen (Zurutuza et al., 1999).

ALP’s zijn Zn++-metalloenzymen (McComb et al., 1979). Katalytische activiteit vereist een multimere configuratie van identieke subeenheden, waarbij elk monomeer één actieve plaats heeft en twee Zn++ atomen die de tertiaire structuur stabiliseren (Kim en Wycoff, 1991).

ALPs worden in het algemeen beschouwd als homodimeer in de circulatie (McComb et al., 1979). TNSALP, in zijn symmetrische dimere vorm, heeft αβ topologie voor elke subeenheid inclusief een tienstrengs β-sheet in zijn centrum (Hoylaerts en Millán, 1991). In weefsels zijn ALPs echter gebonden (zie later) aan celoppervlakken, misschien als homotetrameren (Fedde et al., 1988).

In vitro hebben ALPs brede substraatspecificiteiten en pH-optima die afhangen van het type en de concentratie van de fosfocompound die gekatalyseerd wordt (McComb et al., 1979). Katalytische activiteit vereist Mg++ als cofactor (McComb et al., 1979). Zowel PPi als fosfo-oesters kunnen gehydrolyseerd worden (Xu et al., 1991). De reactie omvat fosforylering-defosforylering van een serine-residu. Dissociatie van het covalent gekoppelde Pi schijnt de snelheidsbeperkende stap te zijn. Pi is namelijk een krachtige competitieve remmer van ALP (McComb et al., 1979; Kim en Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Het kan echter ook zijn dat Pi het enzym stabiliseert (Farley, 1991).

Over de biosynthese van ALP in hogere organismen blijven onzekerheden bestaan. De gensequenties van de menselijke ALP isoenzymen geven aan dat de polypeptiden een korte signaalsequentie van 17-21 aminozuurresiduen hebben (Harris, 1990) en een hydrofoob domein aan hun carboxyl terminus (Weiss et al., 1988b). Intracellulaire degradatie van ALPs kan proteasomen betrekken (Cai et al., 1998). Niettemin verbinden deze ALPs zich aan het buitenoppervlak van plasmamembranen gebonden aan de polaire kopgroep van een fosfatidylinositol-glycan molecuul (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994) en kunnen door fosfatidylinositol-specifieke fosfolipase worden vrijgemaakt (Fedde et al., 1988). Hun precieze interactie met fosfatidylinositol kan echter verschillen tussen ALP-isoenzymen (Seetharam et al., 1987).

Lipide-vrij ALP is het deel dat normaal in de circulatie wordt aangetroffen. De mechanismen voor het vrijkomen van ALP van celoppervlakken zijn echter niet bekend. Het proces zou een fosfatidase van het C of D type, detergentwerking, proteolyse, membraanfractionering, of lipolyse kunnen omvatten (Alpers et al., 1990).

In gezonde mannen en vrouwen is bijna alle ALP activiteit in serum of plasma afkomstig van ongeveer gelijke hoeveelheden van de bot- en leverisovormen van TNSALP (Millán et al., 1980). Zuigelingen en kinderen, vooral pasgeborenen en adolescenten, hebben hogere bloedspiegels van de bot-isovorm (McComb et al., 1979). Sommige personen met B- en O-bloedgroep die “secretors” zijn, verhogen de kleine hoeveelheid intestinaal ALP in hun circulatie na inname van een vette maaltijd (Langman et al., 1966; McComb et al., 1979). Doorgaans draagt het intestinale ALP echter slechts een paar procent bij aan de totale ALP-activiteit van het serum (maximaal 20%) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). Placentair ALP wordt gewoonlijk uitgedrukt en circuleert alleen tijdens het laatste trimester van de zwangerschap (Birkett et al., 1966). Bij verschillende vormen van kanker komt echter placenta of kiemcel (“placenta-achtig”) ALP vrij in de bloedbaan (Millán, 1988). De klaring van circulerend ALP, zoals voor vele andere glycoproteïnen, impliceert waarschijnlijk opname en degradatie door de lever (Young et al., 1984).