VIRAL PLAQUE ASSAY

材料：

5x105cells/mlのSF9細胞の指数培養液30ml

6ウェルプレート（各2）

1瓶 4% Agarose Gel

1瓶 SF-900 (1.)

6ウェルプレート（2）

1瓶 SF-900 (1.3X) 培地

1 本

0.5ml バキュロウイルス上清

100ml SFM

1. 2.細胞をプレートの底に沈降させ、蓋をして1時間インキュベートします。 3.アガロースゲルのボトルを70℃のウォーターバスに入れます。 空瓶とSF-900（1.3X）を40℃の水槽に入れます。 4.常温で1時間培養した後、倒立顕微鏡で単層を観察し、細胞の接着と50％のコンフルエンスを確認します。 採取したウイルス上清を12mLディスポーザブルのSFM培地4.5mLに0.5mLずつ順次希釈し、8倍連続希釈液を作製する。 各ウェルから上清を順次回収し、廃棄した後、直ちに各ウェルに各ウイルス希釈液1mlを補充します。 8.アガロースが液状になったら、ボトルを水槽から滅菌フードに移します。 プラッキングオーバーレイのボトルは、使用するまで40℃のウォーターバスに戻しておきます。 10.順次（高から低へ）ウェルからウイルスを除去し、希釈したアガロース2mlに置き換えます。 真空ポンプに接続したパスツールピペットで簡単に接種痕を除去することができます。

14.Monitorplates daily until the number of plaques counted for two-consecutive days.

15.To determine the titer of the inoculum employed, the optimal range to count 3 to 20 plaques per well of a 6-well plate.リコンビナントウィルスは染色や他の検出法なしで見える、わずかなコントラストのミルキー/グレープラケージを産生する。 力価(pfu/ml)は次の式で算出できる。 アガロースとナチュラルレッド色素の重ね合わせ。

0.5%アガロース溶液をSFMで調製する。

ナチュラルレッド溶液を最終濃度50mg/ml（3.33mg/mlストック1：66.6希釈）まで添加し、各ウェルに1mlオーバーレイ（6ウェルプレートの場合）する。