The engineering principles of combining the transcriptional incoherent feedforward loop with negative feedback

A model of incoherent feedforward transcriptional regulation

3-node systemにおけるインコヒーレントフィードフォワード制御は4種存在する … 続きを読む 本論文では、入力信号（X）が中間出力（Y）と最終出力（Z）の両方を活性化し、YがZを抑制するインコヒーレントフィードフォワードループタイプ1（I1-FFL）モチーフを研究する（図1a）。 Xは入力転写因子であり、YとZのシス制御領域に親和性K1で結合することができる（図1b）。 この結果、Yが転写され翻訳される（図1bの二重矢印）。Yもまた転写因子であり、Zの制御領域と親和性K2で結合することができる。 私たちのモデルでは、XとYの結合は協調的であり（図1bの破線）、その相乗的結合はK12=CK1K2で記述されます。 他の成分間でも協調的な結合が起こる可能性があるが、XとYの間以外の協調性は必要ない（協調性の解析については、Additional file 1を参照）。 したがって、我々の仮説を検証するために必要な1つの協力項のみを残し、したがって我々の主な分析では、他のすべての結合相互作用は非協力的であると仮定する。

プロセス制御工学において、Xはシステムに対する外乱として見られる。標準FF制御（IFFLモチーフ使用）の目標は、XがZに対して持つ効果を取り除くことであり、FFコントローラが適切に調整されれば、出力変数はその望ましい値かその近く（例えば 5%以内)に維持される(図1c)。 一方、生体系ではXは入力信号とみなされ、I1-FFLモチーフは、Zのレベルが過渡応答を示した後、元の値に戻る（近い）ように設計されることが多い（図1d）。 そのため、ピークの高さやZの初期値と最終値の差がパフォーマンスの指標となる(Fig.1d)。 Xは結合親和性K1でYとZの両方を活性化し、一方Yは結合親和性K2で（Xも結合しているとしても）Zを抑制することに注意。 fzの分母の最後の項は協力性の項である（xy/K12 = xy/（CK1K2））。 モデルの導出の詳細はMethodsを参照。

この論文では、t < 0でx = x0 = 1とし、y0とz0の初期定常状態とする。 時刻t=0においてxはステップ的に増加し、x(t ≥ 0) = x1 > 1となり、y、zともに初期に増加するが、ある程度の初期過渡の後、yの増加はzも抑制し始める。 ほとんどのパラメータ値において、この結果、zのピーク値（zpeak）が生じ、その後、新しい定常値z1へと順応していく（図1d）。 ここでは、ピークレベルをP≡（zpeak – z0）/z0、適応度メトリックをf=（z1 – z0）/z0としてそれぞれ正規化しました（図1d参照）。 本稿の残りの部分では、τy = τz = 1、θy = θz = 0.5とする。

タイプIインコヒーレントフィードフォワードループは完全適応にチューニングできる

上記のモデル（式1-3）の以前の分析では、I1-FFL転写調節が適切な条件下では、フォールドチェンジ検出器 (FCD) として作用することが示された 。 FCDとして機能するモデルの必要条件の1つは、最終状態z1が初期状態z0の数%以内（例えば、｜f｜≦ε=0.05）のときに起こる近完全適応（NPA）である。 これまでの研究では、FCDの観点からモデル（式1～3）を分析していたが、このモデル（および一般にI1-FFL）は、適応およびパルス生成という制限の少ない表現型を含む、他のいくつかの表現型を生成できる。

我々のモデル分析は、完全適応（PA）を達成するようにFFLを調整することが可能であることを示すものである。 すなわち、z1＝z0（図2a、bの青い曲線）である。 この条件は、与えられたK1、K2に対して、Cの値が式5（方法参照）で与えられるCPAに等しいときに得られる。 Cの値がCPAからわずかにずれると、PAは失われるが、NPAは維持される可能性がある。 ここでは、f＝＋ε、-εとなるCの値をCNPA＋、CNPA-と定義する（図2a、bの赤と金の曲線）。 この研究の大部分では、ε = 0.05としたが、我々の結果はεの正確な値によって大きく影響を受けることはない（追加ファイル1参照）。 2

x1=10について、CPA値のK1、K2関数としてのヒートマップを図2cに示す。 PAを達成するためには、協調性が必要であることに注意されたい。 K1, K2 ≪1≫では1に近づくが、CPA < 1を達成するために協力性が必要であることに注意されたい（追加ファイル1および図2cを参照）。 Cはfold-change cooperativity parameterであり、C < 1の値は正の相乗効果を表す：XがZの制御領域に結合すると、Yの結合能力が向上し、逆もまた同様である。 他の系で報告されているCの値の下限は、0.01のオーダーである。 したがって、生物学的プロセスのモデルは生物学的に現実的な表現に制約されなければならないので、パラメータ空間の右上の領域（図2c）でPAが達成される可能性は低い。

パラメータ空間の適度な値は生物学的に現実的な表現に対応

Cの大まかな下限を考えると、モデルに他の制約がかけられるかどうかが妥当である。 我々は、モデルに生物学的に現実的な2つの追加的な制約を課した。 第一に、相対的なピークサイズ、P＝（zpeak-z0）／z0は、質の高いシグナル応答を保証するために0.1より大きくなければならない。 図2dにK1, K2の関数としてのPのヒートマップを示す。 このことは、XがZの制御領域に強く結合した場合、xが低い値でもZプロモーターはすでに飽和しているので、xを10倍（1から10）にしても強いピークを生じないことを意味している

次に、zの絶対ピークが0.01より大きくなければならない（図2e）。 我々のモデルはzの最大可能値が1となるようにスケーリングされているので、これはプロモーターの強度と分解速度を考えると、zの最大可能濃度の1％に相当する。 生物学的に検出可能なシグナルを得るために、zpeak = 0.01 を最小値としているが、この最小値を多少緩和しても、我々の結果に大きな影響はないだろう。 CPA、P、zpeakの3つの制約を考慮すると、K1、K2パラメータ空間の小さな領域が「生物学的に現実的」であると判断される。 図2eに3つの等値線すべてをプロットしてあります。 この領域は、「生物学的に現実的な」制約の他の値が選択された場合、再度、修正される可能性があります。 また、生物学的に現実的な領域は、I1-FFL がパルス発生器または完全なアダプターとして機能できるパラメータ空間の領域も限定していることに留意する必要があります（追加ファイル 1 参照）。 そこで、CPAについて、NPAが維持される値Cの範囲を分析した。 図2fにΔCFF ≡ CNPA+ – CNPA-を定義し、ΔCFF/CPAのヒートマップをプロットしました（CNPA+とCNPA-の導出は、Additional file 1を参照ください）。 K1、K2パラメータ空間には、Cの値に関わらずNPAが達成される2つの領域が存在し（Additional file 1、Fig. 2f参照）、いずれもパラメータ空間の生物学的現実領域（Fig. 2fの白抜き領域）には存在しないことが分かりました。 領域Iでは、K1の値が十分に低いため、x0 = 1でもYとZの制御領域はXで飽和しており、YとZはXに対して比較的鈍感である（Additional file 1参照）。 さらに、領域IではK2が十分に大きいため、YはZにほとんど影響を与えない。したがって、xが増加してもzの値はあまり変化せず、z1≒z0ではあるが（つまり｜f｜<ε）、zの値にはピークがない（追加ファイル1：図S1参照）。 このシナリオは、本当の意味でNPAとは言えません。 実際、この領域ではIFFLのノードが切り離されており、IFFLの生物学的表現型（機能）は、互いに独立して作用する2つのノードと区別がつかない

領域IIは、NPAが容易に達成できる領域であるだけでなく、I1-FFLがフォールドチェンジ検出器として機能することが以前に報告されている（追加ファイル1：図S2A） 。 K1 ≫ 1, K2 ≫ 1, K1K2 < 1 のこの領域では，X の結合は線形領域であり，z は x/y の比に依存する。 一方，Zの絶対値は最大値の0.01%に制限される（Additional file 1: Figure S2B）。

一方，生物学的に現実的なパラメータ空間の領域では，ΔCFFはCPAの13%〜65%に制限される（図2f）。 例えば、K1=1, K2=0.1では、NPAの目的を維持するために、システムはCPAに対して約30%の摂動を許容することができる。 つまり、I1-FFLモデルは、NPAに関係するCの変化に対して比較的敏感であることがわかります。 2858>

トランスクリプション負帰還サイクル

工学では、モデルパラメータに対するフィードフォワード制御アルゴリズムの感度は、負帰還ループの作用によって緩和することができる（「方法」の式6～8を参照）。 実際、負のフィードバックは、遺伝子制御の単純化されたモデルにおいて、立ち上がり時間や減衰時間などのI1-FFLの性能目標に頑健性を与えることが示されている 。 しかし、転写FFLモチーフの頻度が高いのとは対照的に、モデル生物である大腸菌には（自己調節を超える）転写サイクルが存在しないことが以前から報告されています . さらに、片方の枝が転写、もう片方の枝がタンパク質-タンパク質相互作用に基づく混合型ネガティブフィードバックループが広く使われていることを認めつつ、転写型ネガティブフィードバックは稀であることが、おそらく二重転写ループの緩慢な性質によるのだろうという研究結果がある . そこで、最近更新された大腸菌の転写相互作用のデータセットを解析したところ、長さ2のサイクルが17例見つかり、そのうち5つが正帰還、9つが負帰還、3つが混合型であることがわかった。 これらの相互作用のうち、1つの負帰還サイクルは複数のI1-FFL構造内に埋め込まれていた（追加ファイル2参照）。

フィードフォワード/フィードバック複合システムは、フィードフォワードのみのシステムよりも堅牢である

IFFLモチーフにおけるNPAの堅牢性を高めるFBループの効果に関する予測から、F/FB複合システムについても調査した。 図3a、bに示すように、Zによって活性化され、Zを抑制する第4のノードWを追加した。 これらの相互作用により、2つの親和性結合パラメータ（K3、K4）、Wの転写/翻訳遅延（θw；図3b参照）など複数の新しいパラメータがモデルに導入された（Methods参照）。 3

2つのシステムを直接比較するために、図3fに比率ΔCFFFB/ΔCFFをプロットしました。 生物学的に現実的な値の範囲では、ΔCFFFBはΔCFFより21％–54％大きい（比は1.21–1.54）。 (図3e, fの生物学的に現実的な領域は、FF/FB系であることに注意。 図S3参照)。 実際、K1, K2パラメータ空間の小さな領域（領域II付近）を除いて、FF/FBシステムはFFのみのシステムよりも常に優れている（比率が1より大きい）。 NPAの目的に対してFF/FBシステムが有利であることから、次にFF/FBシステムの動的特性も有利であるかどうかを調べた。

前述のように、解析ではNPA表現型の頑健性を説明するために必要な相互作用のみを残そうとした。 そのため、XとYの間の相互作用にのみ協力性が含まれていた。 また、XとW、あるいはYとWの協調性を取り入れることも考えられますが、I1-FFLにFBモジュールを追加することでシステムの頑健性が高まるという結果には定性的には影響しません（追加ファイル1：図S4）。 さらに、我々の結果はεの正確な選択に依存しない（Additional file 1: Figure S5）。

動的解析により、FF/FBシステムはFBのみのシステムよりも優れていることがわかった

負のフィードバックループは複数の欠点に悩まされることになる。 まず、比例フィードバック（これは生物系に自然に起こる最も一般的なメカニズムである）は常にオフセットになる（図4a参照）。 つまり、外乱がシステムを動揺させた後、出力は元の値には戻らない。 これを緩和するために、負のフィードバック応答の強さを大きくすることが考えられる。 しかし、この場合、負帰還の2つ目の大きな欠点が生じることが多い。特に遅延の大きい系では、強い負帰還によって動的不安定やリンギング振動が生じることがある（図4b）。 一方、FFLによって一次外乱の一部または全部を除去することができれば、両方の欠点を回避することができる（Fig.） これらの原理を遺伝子制御系で調べるために、FBのみのモデルとFF/FBを組み合わせたモデルの挙動を比較したところ、FB/FBを組み合わせたモデルの方が、FF/FBを組み合わせたモデルよりも、より高い精度を得ることができました。 図4

FBのみとFF/FB複合のダイナミクス a (比例) 負帰還のみ（青曲線）は、摂動によって常に元の値からオフセットされる。 FF/FBを組み合わせたシステムでもオフセットが発生するが、FF/FBシステムのI1-FFLは完全に適応するように調整することができる。 b FBシステムにI1-FFLを追加することで、より安定したダイナミクスが得られる可能性があります。 c FBのみのシステムにおける主固有値の実部（α）のヒートマップ。 黒線はα=0となるコンターで、FBのみの系の安定限界を示す。 K4の値を小さくすると、不安定な系になる（B部参照）。 d C と同じだが、FF/FB 複合系の場合。 e 2つの系の主固有値の実部の差であるΔαのヒートマップ。 ゼロの輪郭の右側では、Δαの値がゼロより大きくなっており、FF/FB系がより迅速に定常状態に近づいていることを示している。 黒と白の曲線はそれぞれFBのみとFF/FBシステムの安定性の境界を示している（パートC、Dも参照）

FBのみとFF/FB複合システムの両方の安定性を決定するために、K3、K4の値を変えて主固有値（追加ファイル1参照）の実部であるαを求めた（FF/FBシステムではK1 = 1, K2 = 0.1; 図4c、dを設定した）。 どちらの系が明らかに優れているということはないが、ZによるWの活性化が中程度（K4≒0.1以上）の場合、強い負帰還（K3 < 0.1）は不安定なFBのみの系になる傾向があり、FF/FB系は常に安定であることがわかる。 実際、Wが適度に活性化するこの領域では、αFB – αFFFB > 0となる（図4e）。 また、両系統が安定している場合でも、αFFFB < αFBはFF/FB系が早く定常状態に達することを意味している（例えば、図4a参照）。 しかし、2層目の制御を追加すると、ある領域で得た利点が別の領域で不利になるというトレードオフが生じることがよくあります。 そこで、他の2つの目的である正規化ピークPと絶対ピークzpeakに関して、FBのみとFF/FB複合モデルの性能を比較する。

A combined FF/FB system achieve compromise on multiple objectives

FF/FBシステムの性能をFBのみのシステムと比較するために、K3、K4を0.01から1まで変えながら両システムでzのピーク値を計算しました。 まず、FBのみのシステムの正規化ピークPは、およそ0.7から1の範囲であることがわかった（Fig.5a）。 一方、FB/FBシステムの正規化ピークはK3, K4の値にほぼ依存せず、およそ1.256であった（追加ファイル1：図S6を参照）。 したがって、FF/FBシステムは、この指標においてもFBのみのシステムを上回る。FF/FBシステムは、FBのみのシステムに対して30〜80％の改善となる（図5b）

FB のみシステムと FF/FB 複合システムの性能指標の比較。a FB のみシステムの正規化ピーク、P のヒートマップ。 このパラメータ（およびこの図で定義されている他のパラメータ）は、不安定なシステムでは定義されません。 この指標によると、FF/FBシステムは常にFBのみのシステムより優れている。 しかし、PFFFBの指標はK3, K4の値に関係なく0.46でほぼ一定である（追加ファイル1参照）。 c FF/FBシステムの絶対ピークZpeakのヒートマップ、K3, K4の値を変化させた場合。 ピーク値の絶対値はせいぜい0.06であることに注意。 d FF/FBシステムの絶対ピークとFBのみの絶対ピークの比。 この指標によれば、FBのみのシステムは常にFF/FBシステムより優れている(比率は1未満である)。 しかし、FF/FBシステムが優れている他の性能目標を考えると、これは許容できるトレードオフです

複合システムの一つの大きな欠点は、出力の二つの抑制器（YとW）により、（その最大可能レベルに対して）出力のレベルが低いということです。 選択したパラメータ値（K1 = 1, K2 = 0.1）において、zpeakは下限値0.01を超えている（Fig. 2e参照）。 しかし、これはFBのみのシステムで見られたzpeakの値よりもかなり低い（Fig.5d）。 つまり、FB/FB複合システムは、絶対的なピーク値では妥協するものの、そのダイナミクスと正規化されたピーク値では優れている

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