Regulation of Cholesterol Synthesis

00:00:08.12My name is Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03and I’m from Department of Molecular Genetics
00:00:12.03.この発表では、
00:00:17.19 HMG CoA還元酵素のフィードバック制御
00:00:20.についてお話させていただきます。
00:00:25.06 では、このスライドにコレステロール
00:00:27.06の構造と、この重要な分子の特性のいくつかを示しています。
00:00:31.01コレステロールはステロールの一種で、
00:00:33.10この4つの環状構造によって区別されます。
00:00:36.00この4環状構造によってこの分子に剛性が付与され
00:00:39.
00:00:43.18 さて、コレステロールは多数の
00:00:46.07の炭素-炭素および炭素-水素結合を持つため、
00:00:49.この分子は事実上、水に溶けません。
00:00:52.07このため、
00:00:54.13細胞はコレステロールを狭い範囲で維持できなければなりません
00:00:58.
00:01:02.13 細胞が必要とする分のコレステロールは生産されますが、毒性のあるコレステロールの過剰蓄積は避けられます。
00:01:06.16コレステロールの過剰蓄積は、細胞レベルで毒性を持つ可能性があります。
00:01:12.11 さて、このスライドでは、コレステロールの必須機能のいくつかをご紹介します。
00:01:15.10コレステロールは生命にとって絶対に必要です。
00:01:17.26先ほども述べたように、
00:01:19.27コレステロールの最もよく知られた役割の1つは、細胞膜での役割で、
00:01:25.08そこで最適な膜流動性を維持します
00:01:29.00さて、コレステロールは、ステロイドホルモン
00:01:34.25のような非常に重要な分子の重要な前駆体であることが判明しています。
00:01:47.10 そして最後に、コレステロールは脳に多く存在します
00:01:50.
00:01:58.18 さて、私たちの体の細胞、つまり哺乳類の細胞は
00:02:02.01に2つの供給源からコレステロールを摂取しています
00:02:04.21そのうちの1つは、このスライドに示されているように、前駆体のアセチルCoAからコレステロール
00:02:09.19が合成されることです。
00:02:20.22 さて、ご想像のとおり、
00:02:22.21コレステロールの合成には、いくつかの中間体の生成が含まれます、
00:02:26.16であり、これらの中間体自体
00:02:29.14も非常に重要な最終生成物に変換されます。
00:02:33.11例えば、この化合物はファルネシルピロリン酸
00:02:36.29は、ドリコールという重要な化合物の前駆体であり、
00:02:40.25はN-結合型グリコシル化に関与しています。
00:02:43.26また、ヘムやユビキノンという細胞呼吸に関わる物質の前駆体であったり、
00:02:47.10は
00:03:01.26ビタミンKは血液凝固に関与しています。
00:02:53.12そして最後に、このファルネシルピロリン酸とゲラニルゲラニルピロリン酸
00:02:58.06は多くのシグナル伝達タンパク質と結合して、
00:03:01.この修飾は、正常な細胞機能にとって絶対に必要です。さて、このスライドでは、コレステロール
00:03:16.02が様々な組織で異なる速度で合成されることを示しています。
00:03:19.29 さて、肝臓と副腎
00:03:23.14は我々の体内で最も多くコレステロールを合成しています。
00:03:25.10 また、これは実際にマウスで行われたことですが、
00:03:28.06 でも同様の効果が人間
00:03:31.07 やその他の霊長類にも見られます。
00:03:36.24 主にリポタンパク質の生産
00:03:39.14と胆汁酸合成
00:03:42.10副腎はコレステロールを生産
00:03:45.
00:03:48.13 一方、腸は細胞分裂のためにコレステロールを合成します。
00:03:54.12腸では毎日大量の細胞が剥がれ落ちています
00:03:57.
00:03:59.27 コレステロール合成の著しい量を必要とします。
00:04:03.28 また、腸はリポ蛋白の生産源でもあることを指摘しておきます。
00:04:09.21 では、次にコレステロールの
00:04:12.12は、実は肝臓と腸で作られるリポタンパク質
00:04:15.16から供給されるのです。06そこで、ここに示すのは低密度リポ蛋白のモデルです。
00:04:23.02これは人間の血漿中の主要なコレステロール運搬体です。
00:04:28.02そこで、低密度リポ蛋白、すなわちLDLは、
00:04:31.14は遊離コレステロールからなるコアで構成されています。
00:04:36.19つまり、疎水性コレステロールがLDL粒子のコアを形成しています。
00:04:41.19さて、この疎水性コレステロールは
00:04:44.その周囲をリン脂質
00:04:47.02と様々な量のエステル化コレステロール
00:04:51.13–これは脂肪酸が結合したコレステロール–
00:04:55.
00:04:59.03 さて、このLDL粒子全体
00:05:02.18はアポリポ蛋白質Bと呼ばれる蛋白質に囲まれています
00:05:08.02そこで、このスライドには実際に
00:05:10.
00:05:13.13 内生合成とLDLからです。
00:05:18.19 LDL受容体
00:05:21.09 — 細胞表面に存在します —
00:05:23.
00:05:32.25 LDL粒子がLDL受容体に結合すると、
00:05:35.27その複合体全体が被覆ピットに内在化されます。
00:05:40.06そして、この被覆ピットはリソソームへと移動し、
00:05:43.07ここでLDL粒子が分解され、コレステロール
00:05:47.
00:05:54.18 つまり、細胞内のコレステロールは
00:05:58.03の2つの供給源、つまり受容体から供給されるか、
00:05:49.25に供給されて、様々な用途に使われるわけです。
00:06:09.01 例えば、LDLが制限されると、
00:06:12.00細胞はコレステロールの供給源を内因性合成に切り替えます。
00:06:18.02 また、内因性合成が阻害されると、
00:06:20.05 細胞はコレステロールの供給源として外因性LDL
00:06:23.01を使用することができます。
00:06:27.00 さて、コレステロールの必須機能についてはお話ししてきましたが、いかがでしたか？
00:06:30.10 細胞膜に重要であること
00:06:32.11 ステロイドホルモン
00:06:34.28 胆汁酸
00:06:36.16 しかし、コレステロールの悪い面もあり、
00:06:38.13 このスライドでそれを説明します。
00:06:41.00 長年にわたり、血中LDLコレステロール
00:06:46.14のレベル上昇は、冠動脈心疾患
00:06:49.19や心臓発作のリスクと関連しています
00:06:51.16そこで、ここで示すように、
00:06:54.これは、コレステロール
00:07:01.09が上昇すると、実際に心臓につながる動脈に沈着する可能性があるからです。
00:07:08.12 そして、この沈着
00:07:11.15は、アテローム性動脈硬化症と呼ばれる病気になり、コレステロール
00:07:15.04が沈着すると、プラーク
00:07:17が生成されることがあるのです。
00:07:23.06 さて、LDLコレステロール
00:07:28.16を下げるために最も広く処方されている薬の一つが、スタチン
00:07:33.11という一群の薬である。03ここに示すのは、スタチンの典型的なコア構造
00:07:37.26と、臨床で利用されてきたスタチンの様々な形態の一部
00:07:41.29です。
00:07:44.22 長年に渡り、スタチン
00:07:47.12は最も…
00:07:49.10 米国で最も売れている薬
00:07:51.20血中LDLコレステロールを低下させる能力があるからです。
00:07:57.19そこで、この実験では、少なくとも4件の研究
00:08:02を要約して示しています。23その結果、スタチンは確かにLDLコレステロールを減らし
00:08:06.06、その減少が冠状動脈性心臓病の発生率の減少
00:08:10.04につながることが明らかになりました。
00:08:12.11ここで閉じている丸に示したのは臨床試験
00:08:15.11で、患者は…閉じた円で示したスタチンで治療され、
00:08:20.22またはプラセボで治療されました。
00:08:22.11そしてこれらの試験のそれぞれで、スタチン治療は
00:08:25.17LDLコレステロールレベルの低下、
00:08:28。このLDLコレステロール値の低下が
00:08:31.19につながり、冠動脈イベント、つまり心臓発作が減少しました。
00:08:35.13そこで、問題は、スタチンはどのようにして働くのか
00:08:38.21そしてスタチンには何があるのか
00:08:40.ということになる。
00:08:43.16 スタチンはHMG CoA還元酵素を阻害します。
00:08:47.05HMG CoA還元酵素は、コレステロールの合成における律速段階である
00:08:50.20を触媒します00:08:53.
00:08:58.06 だからスタチンは、還元反応の産物である
00:09:05.13メバロン酸を模倣して、HMG CoA還元酵素を競合的に阻害するのです
00:09:07.20.20つまり、この還元酵素の競合的阻害
00:09:10.19が、スタチンが血中のLDLコレステロールをダウンレギュレート
00:09:14.18する能力の根拠となっています。
00:09:18.07 では、スタチンにはどんな働きがあるのか？
00:09:20.17 やはりHMG CoA還元酵素の競合阻害により
00:09:24.
00:09:30.18 このコレステロールの枯渇は、LDL受容体をコードする遺伝子
00:09:36.06の転写の増加
00:09:33.12につながると考えられています。
00:09:37.25 その結果、表面上のLDL受容体の数が…
00:09:41.14、特に肝細胞の数、
00:09:43.15、このLDL受容体の増加が
00:09:48.01、血液LDL取り込みを増加または促進します
00:09:52.1.25そして、この血中LDL
00:09:55.26の減少が、スタチン治療患者の冠動脈疾患
00:09:58.20の低下の原因となる。
00:10:02.12 しかし、スタチン
00:10:05.26の臨床効果は、実は
00:10:09によって鈍らされるのである。
00:10:13.19 これはHMG CoA還元酵素タンパク質の免疫ブロットです
00:10:15.13これはスタチン治療に伴うHMG CoA還元酵素の増加によって
00:10:19.スタチンを投与したマウスの肝臓
00:10:22.17、あるいはin vitroでスタチンを投与した培養細胞
00:10:25.00でも見られます。
00:10:26.24そしてご覧のように、スタチン処理によって
00:10:28.20に著しい蓄積が生じます。
00:10:33.10 そしてこの蓄積は、先ほど申し上げたように、スタチンの臨床効果を鈍らせます。
00:10:38.12そこで次の質問は、なぜスタチンによって
00:10:41.27HMG CoA reductaseがそれほど高いレベルまで蓄積されるのか、ということです。
00:10:44.14
00:10:47.02
00:10:49.29 通常、HMG CoA還元酵素は膨大な量のフィードバック制御を受けているわけですが、
00:10:51.25
00:10:49.02
00:10:49.29
00:10:47.03
00:10:49.03
00:10:55.02 そしてこのフィードバック制御は、一部
00:10:57.29 ステロールによって媒介されています。
00:11:00.02 さて、スタチン治療は、先ほど申し上げたように、
00:11:02.05 HMG CoA還元酵素活動をブロックし、00:11:04.12 これらのステロール分子の合成を阻止するのです。
00:11:07.29 そしてもちろん、このステロール合成の阻止
00:11:10.26は、実際にLDL受容体のアップレギュレーション
00:11:14.17とそれに続くLDLコレステロールの減少の原因となっているのです
00:11:18.しかし、スタチン
00:11:21.03はステロールの合成を阻害するため、
00:11:22.18還元酵素のフィードバック制御を妨害します。
00:11:25.14その結果、三つの出来事が起こります。
00:11:27.28まず、コレステロールが減るため、
00:11:31.09とコレステロール合成経路の他の産物が減少し、
00:11:35.08還元酵素遺伝子の転写が促進され、
00:11:39.07還元酵素mRNAの翻訳が促進され、
00:11:43.18還元酵素mRNAは、
00:11:41.28還元酵素の翻訳が促進され、
00:11:43.
00:11:47.13 前のスライドでお見せした還元酵素タンパク質の著しい増加
00:11:49.19は、これら3つの事象が原因となっているわけです。
00:11:55.18 そこで長年にわたり、
00:11:57.06 私の研究室では、
00:11:59.27 このタンパク質の安定性向上の根拠となる分子メカニズムを理解しようと努めてきました
00:12:02.22
00:12:04。
00:12:09.16So, this slide illustrates that sterols
00:12:13.08indeed accelerate the degradation
00:12:15.26of HMG CoA reductase.
00:12:17.14So, in this experiment,
00:12:19.この実験では、古典的なパルスチェイス分析
00:12:20.29を用いて、ステロールの非存在下または存在下で処理した細胞
00:12:23.16の還元酵素の安定性をモニターしました。
00:12:29.27 HMG CoA還元酵素分子の小さなサブセットを標識します。
00:12:33.25次にその放射能を除去し、
00:12:35.25還元酵素タンパク質の安定性をステロールの不在または存在下で追跡調査します。
00:12:44.10 そしてここでご覧いただけるように、
00:12:46.08放射能を含まない培地で細胞を追跡すると、
00:12:49.07ステロールが存在しない場合
00:12:52.28還元酵素は時間と共にかなり安定していることがお分かりいただけます。16しかし、ご覧のように、
00:12:57.21追跡媒体中にステロールを添加すると
00:12:59.26還元酵素レベルが著しく低下するのです
00:13:02。20ここでも、ステロールによるHMG CoA還元酵素の分解促進
00:13:06.04が示唆されている。
00:13:09.16さて、分子メカニズムを理解するために
00:13:11.22このステロールによる還元酵素の分解を理解するためには、
00:13:14.15HMG CoA還元酵素タンパク質の構造を理解する必要があります。
00:13:22.18 HMG CoA還元酵素
00:13:24.16は二つの異なるドメインから構成されています。
00:13:26.28 N-末端ドメイン
00:13:29.06があり、これが小胞体
00:13:32.14あるいはERの膜にタンパク質を固定します。
00:13:35.00さて、このN末端ドメイン、
00:13:36.29は膜ドメインと呼ばれ、
00:13:39.
00:13:42.05 そして、HMG CoA還元酵素の第2のドメイン、
00:13:45.07が続いており、これは触媒ドメインと呼ばれています。24つまり、触媒ドメインは細胞の細胞質内に突出し
00:13:51.24、HMG CoA還元酵素のすべての酵素活性を含んでいます。
00:13:56.03実際、還元酵素の切断型
00:13:59.触媒ドメインのみを含む
00:14:02.13は、HMG CoA還元酵素を欠く細胞においてメバロン酸
00:14:06.28の合成を完全に救済することができます
00:14:10。
00:14:13.01 メバロン酸の合成には触媒ドメインが必要かつ十分である
00:14:15.29そこで疑問が出てきますが、
00:14:17.28なぜこのタンパク質は膜結合型なのでしょうか？
00:14:19.26 そして、還元酵素
00:14:22.02は、実は酵母の時代から膜結合型のタンパク質であったことがわかりました。この実験では、触媒ドメイン
00:14:35.08–つまりすべての酵素活性を含む–
00:14:37.26と完全長の酵素の安定性を比較しました
00:14:40.20また、単純なパルス追跡分析
00:14:42.21を使って、これら2つの蛋白質の安定性をモニターしています。
00:14:47.13 左のパネルにあるように、
00:14:49.03 触媒ドメインを切断すると、
00:14:53.14 非常に安定したタンパク質が生成され、・・・重要なことに、
00:14:57.
00:14:59.20 対照的に、完全長タンパク質（これも膜ドメインを含む）は、ステロールがない場合でさえ、安定性に欠ける。
00:15:06.13 そして、ステロールがHMG CoA還元酵素の分解を著しく促進することがわかります
00:15:09.25このことは、膜ドメインが…
00:15:15.09.
00:15:17.25 この膜ドメインの機能は、このステロール促進またはステロール誘発分解であることがわかりました。また、膜ドメインが、直接的または間接的に
00:15:33.16、
00:15:35.16、細胞内のステロールのレベルを感知することが示唆されたのです。02還元酵素膜ドメインの構造変化
00:15:43.29によって、タンパク質は急速に分解されやすくなります。14そしてもちろん、スタチンはコレステロールの合成を阻害するため、
00:15:52.01スタチンは、我々がER関連分解（ERAD）と呼ぶ、HMG CoA還元酵素の
00:15:57.08を実際に阻害するのである。23そこで、HMG CoA還元酵素のERADに関する我々の理解
00:16:04.23における重要な突破口は、一対のタンパク質
00:16:08.15を発見することでもたらされたのです。
00:16:10.23 Insig-1とInsig-2と呼ばれる2つのタンパク質です。
00:16:14.15このInsigタンパク質は、この講演では
00:16:16.27非常に重複しています。
00:16:22.06 HMG CoA還元酵素の分解（ERAD）において冗長な役割を担っています。
00:16:24.00 これらは同一…約85%同一で、
00:16:26.23 高度に疎水性のタンパク質です。
00:16:29.24 さて、HMG CoA還元酵素のERADにおけるInsigsの役割は、この実験で初めて明らかにされました。
00:16:37.19ここで再び、パルスチェイス分析
00:16:40を使いました。15を用い、コントロール分子
00:16:51.02をトランスフェクトした細胞
00:16:47.02で還元酵素のステロールによる加速分解
00:16:43.29を測定しています。また、Insig-1とInsig-2の両方の発現をノックダウンするようなsiRNA
00:16:55.26でトランスフェクトした細胞
00:16:58.13。07そして、左のパネルにあるように、
00:17:04.13コントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞では、
00:17:08.04ステロールはHMG CoA還元酵素の分解
00:17:12.07を著しく加速させるのだそうです。
00:17:14.13 開いている円は、ステロールがない状態で行った実験
00:17:17.09、閉じている円はステロールの存在下で行った実験
00:17:20.15です
00:17:22.12そして、すぐにわかることは、Insig-1とInsig-2をノックダウンすると
00:17:26.23ステロール加速分解が完全に停止することであり、
00:17:30.02 このことは、これらのタンパク質が
00:17:32.
00:17:35.27 そこで次の質問ですが、
00:17:38.02 InsigsがHMG CoA還元酵素のERADを促進するメカニズム
00:17:39.26は何なのでしょうか？
00:17:47.09 では、この実験…
00:17:48.21 このスライドでは、プロテアソーム（26Sプロテアソーム）の阻害剤が、ステロールによるHMG CoA還元酵素の分解を阻害していることが示されています。
00:17:57.15 この実験でわかるように…
00:18:00.18 最初の2つのレーンでは、ステロールによって還元酵素が著しく分解されました
00:18:04.
00:18:06.19 この細胞をプロテアソーム阻害剤で処理すると、この分解は完全にブロックされます。
00:18:12.03そこで…これで別のモデルを作ることができます
00:18:15.この場合、還元酵素の膜ドメイン
00:18:18.25が直接または間接的に
00:18:21.22に細胞内ステロールのレベルを感知し、
00:18:24.その結果、還元酵素はインシグに結合し、
00:18:28.12、インシグの結合によって還元酵素
00:18:32.06が26Sプロテアソームによって分解されるようになる。
00:18:37.22 さて、プロテアソームの基質のほとんどは、事前にユビキチン化を必要とすることが知られています
00:18:41.05ユビキチン化は、
00:18:46.ユビキチン鎖が基質に結合すると、
00:18:54.16は基質分子に
00:18:56.
00:19:00.25 さて、これはポリユビキチン化と呼ばれ、
00:19:02.25タンパク質のポリユビキチン化は
00:19:05.
00:19:07.29 このスライドにそれを示しています。
00:19:11.09最初のステップでは、
00:19:13.15ユビキチンが活性化されます
00:19:15.次のステップでは、ユビキチンはE1から…
00:19:27.
00:19:32.16 最後のステップでは、E2がE3、
00:19:36.24またはユビキチンリガーゼ、
00:19:39.に結合する。E3が行うのは、ユビキチン結合酵素
00:19:47.27からユビキチン
00:19:50.00へのユビキチンの移行を促進することです。基質タンパク質のリジン残基に移動し、
00:19:53.08ユビキチン化基質を生成します。
00:19:57.28このプロセスは何度も発生し、
00:20:00.ユビキチン鎖が基質タンパク質に構築されるまで。
00:20:06.02その基質タンパク質がプロテアソームによって認識され、分解される。
00:20:10.18そこで、これらのInsigタンパク質
00:20:12.26が還元酵素の分解に必要であること、そして還元酵素は実際にプロテアソームによって分解されること、
00:20:19.02次の疑問は、還元酵素はユビキチン化されるか？
00:20:23.20 この疑問は、このスライドにある実験
00:20:26.11で答えられました。
00:20:28.21この実験で行ったことは、細胞を
00:20:31.この実験では、ステロール
00:20:33.20とプロテアソーム阻害剤
00:20:37.05の非存在下と存在下で細胞を処理し、その後に還元酵素を免疫沈降
00:20:40.11しています。そして、その免疫沈降物を、下のパネルに示すように、全還元酵素
00:20:43.20、またはユビキチン化還元酵素
00:20:49.18のいずれかについて調べました。07最初のレーンにあるように、
00:20:51.01還元酵素はこの実験ではプルダウンされていますが、
00:20:55.11ユビキチン化と反応性は見られません
00:20:58.
00:21:03.09 そして、このユビキチン化は、プロテアソーム阻害剤を併用すると、顕著に増加します
00:21:07.22。
00:21:09.27 つまり、このことからわかるのは、ステロール
00:21:12.16によって還元酵素がユビキチン化され、
00:21:14.20でユビキチン化したタンパク質はプロテアソームによって分解される、00:21:17.ということなのです。ユビキチン化還元酵素の安定性が示すように
00:21:21.21はプロテアソーム阻害剤によって分解されます。
00:21:24.27 次の質問ですが、
00:21:27.
00:21:32.16 そして再び、siRNAに目を向けます。
00:21:35.08細胞は、コントロールsiRNA
00:21:38.のいずれかでトランスフェクトされました。
00:21:41.03 次に、これらの細胞をステロールの非存在下または存在下で処理し、
00:21:43.20 ユビキチン化還元酵素のプローブを行いました。16そして最初の2つのレーンでわかるように、
00:21:49.10還元酵素はステロールの存在下でうまくユビキチン化され、
00:21:52.08Insig-1とInsig-2をノックダウンすると、
00:21:56.
00:22:01.01 HMG CoA還元酵素のInsigを介したERADのモデル
00:22:04.07で、より多くのギャップを埋めることができるようになったのです
00:22:09。14さて、Insig分子のサブセット
00:22:12.00は、実際にE3/E2ユビキチンリガーゼ複合体と結合することが判明しています。15還元酵素の膜ドメイン
00:22:23.03がステロールを感知し、
00:22:24.25この感知によって還元酵素はInsigsに結合し、
00:22:27.28当然ながらこれらのInsigs
00:22:31.この橋渡しにより、膜ドメインにある2つのリジン残基で還元酵素
00:22:40.00がユビキチン化されることになるのです。
00:22:43.17 そしてこのユビキチン化によって還元酵素
00:22:46.17はER膜から除去され
00:22:50.09、その後プロテアソームによって分解されます
00:22:52.
00:22:55.07 完全に解明されているわけではないプロセスを通してです。
00:23:00.20つまり、今日お話したことをまとめると
00:23:03.HMG CoA還元酵素はコレステロール合成経路の律速酵素
00:23:06.07であり、コレステロールを低下させるスタチン系薬剤の標的であること
00:23:11.01をお伝えしました。26還元酵素は非常に複雑な
00:23:15.16フィードバック制御システム
00:23:18.01によって制御されており、コレステロールや他の種類のステロールが介在しています
00:23:20。そして、スタチンはこのフィードバック制御システムを破壊し、
00:23:24.03一部、このInsigが媒介するHMG CoA還元酵素のユビキチン化
00:23:27.10とERADをブロックすることによって、。