Plasmid-Mediated AmpC β-Lactamase CITM and DHAM Genes Among Gram-Negative Clinical Isolates

Background

一部のグラム陰性菌の薬剤耐性化は世界規模で発生している（Enterobacterales、 Acinetobacter baumannii、 Pseudomonas aeruginosa）． 腸内細菌科の中でも、大腸菌やクレブシエラ菌は、顕著な薬剤耐性を示す菌として頻繁に分離されている。 このグループは、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバペネム系、モノバクタム系の4つの主要な化学クラスを含み、カルバペネム系はグラム陽性、グラム陰性、嫌気性細菌の病原株に対する経験的治療の最後の手段として使用されています2。

β-ラクタム系抗生物質に対する耐性は、β-ラクタマーゼという加水分解酵素の産生に起因し、細胞質膜にあるペニシリン結合タンパク質（PBPs）に達する前に抗生物質を不活性化することができる。3 主要なβ-ラクタマーゼファミリーには、プラスミド媒介性拡張型βラクタマーゼ（ESBLs）やAmpC、セフェロスポリナーゼおよびカルバペネマーゼが含まれる。 AmpCβ-ラクタマーゼをコードする遺伝子は広範囲に拡散し，細菌のプラスミドから広く検出されるようになった1

。 1989年に韓国で分離されたKlebsiella pneumoniaeから初めてプラスミドにコードされたAmpC変種が同定された。 その後、K. pneumoniaeやE. coliを中心に、プラスミドを介したAmpC変種が多数検出されるようになり、CMY-1と名づけられました。 プラスミドを介したAmpC遺伝子型を持つ細菌は、核酸配列の相同性に基づいて帰属され、これらのプラスミドと多数のAmpCファミリーの供給源となる細菌属の数が多く形成されました6。 現在までに、Aeromonas hydrophilaとCitrobacter freundiiからそれぞれ分離されたCMY β-ラクタマーゼ2ファミリー（CMY-1とCMY-2）、Aeromonas属からFOX型とMOX型酵素が世界的に報告されている。H. alvei由来のACCファミリー、C. freundii由来のLATファミリー、Enterobacter属由来のMIRファミリーおよびACTファミリー、Morganella morganii由来のDHAファミリーなどである4,6,7。 プラスミドにコードされたAmpC遺伝子の多くは、院内感染の大腸菌や肺炎桿菌に見られるが、E. cloacae, C. freundii, S. marcescens, M. morganiiなどの他のグラム陰性菌は、染色体を介したAmpC βラクタマーゼによって耐性化し、広域セファロスポリンに対する抵抗性を高めている(8)。 さらに，AmpCβ-ラクタマーゼ遺伝子，特にMOXM，CITM，DHAM，EBCM，FOXM，ACCMは，セフェピムとカルバペネム以外のほとんどのβ-ラクタム薬に対する広域耐性の発現に関与している． また、クラスA酵素の阻害剤（クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタムなど）やp-クロロメルクリベンゾエートは、タゾバクタムやスルバクタムで阻害できるものもあるが、AmpC β-ラクタマーゼに対しては有効ではないため、菌体内にこれらの遺伝子を獲得することでさらに耐性が強化されることになる。6

薬剤耐性菌の増加や蔓延を抑制するための取り組みが行われているが，資源に乏しい環境でのAmpC β-ラクタマーゼに関する研究はまだ十分とはいえない状況である。 抗菌薬耐性菌の増加に対応するために最も重要なことは，診断室において病原性（あるいは耐性）株を正確に検出することである。 しかし，AmpCβ-ラクタマーゼは表現型検査だけでは同定が難しく，臨床検査室ではしばしばESBLsとして誤検出されるため，ネパールではルーチン報告用の検査プロトコルは正確な結果を提供できていない。 ESBL表現型のスクリーニング検査で陽性となり、確認検査で陰性となった腸内細菌科の分離株は、通常、染色体抑制またはプラスミド転移によるAmpC β-ラクタマーゼ産生菌と考えられる9

専門的な臨床微生物学者でさえプラスミド媒介のAmpC β-ラクタマーゼを特定できないため、より正確かつ特異的に迅速に検出する方法の必要性が提案されている。 しかし，これらの方法の中には，試薬の入手が困難であるなど，多大な労力を要するものもある10． そのため，様々な臨床感染症におけるAmpC β-ラクタマーゼ発現の原因となるプラスミドにコードされたAmpC遺伝子の診断を容易にするため，より信頼性と有効性の高いmultiplex polymerase chain reaction（PCR）からなるラボプロトコルが考案された11

ほとんどの研究は，ネパールにおける臨床分離グラム陰性細菌のESBL酵素の有病に焦点を当てている12-16． カトマンズバレーで実施されたある研究では，表現型法を用いてEnterobacteralesの27.8％がAmpC β-lactamases産生菌であると報告されている17。我々の知る限り，ネパールで表現型法と遺伝子型法の両方を用いたグラム陰性菌のAmpC β-lactamases酵素の検出と特徴付けに関する研究は限られている。 病院における薬剤耐性菌のスクリーニングには，表現型および遺伝子型の標準的な抗生物質感受性試験法の確立が必要である。 本研究は、表現型スクリーニングと確認法の両方を用いて、グラム陰性菌分離株におけるAmpC β-ラクタマーゼ遺伝子（blaCITMおよびblaDHAM）を分離・同定するために行われた

方法

研究デザイン

これはAnnapurna Neurological Institute and Allied Sciences（ANIAS）で2017年6月から2018年1月に行った病院ベースの横断的研究である。 合計1151の重複しない臨床サンプルが収集され、研究期間中に処理された。 サンプルは、尿（n=412）、血液（n=206）、カテーテルチップ（n=163）、膿（n=132）、便（n=89）、CSF（n=53）、創傷スワブ（n=58）、膣スワブ（n=38）であった。 検体は，滅菌され，ラベルが貼られ，漏れない容器で採取され，できるだけ早く処理された18． 9353>

Culture of Specimens and Identification of the Isolates

Samples were collected according to standard microbiological guidelines for collection of urine, stool, pus, blood, CSF and catheter tip.また、標準的な微生物学ガイドラインに従って、尿、便、膿、血液、髄液、カテーテルチップを収集した。 採取した検体は，血液寒天培地（BA），チョコレート寒天培地（CA），MacConkey寒天培地（MA）で培養した． また，尿検体は発色UTI寒天培地に植菌した． 分離菌は、コロニーの形態学的外観、染色反応、生化学的特性などの標準的な微生物学的パラメータを用いて同定された19,20

抗菌薬感受性試験

すべての分離グラム陰性菌は、修正カービーバウアーディスク拡散法によるin vitro抗菌薬感受性試験が行われた21。 接種液の濁度は、CLSIガイドラインの0.5McFarland標準に相当する値とした。 また，Muller-Hinton寒天培地（MHA）上に試験接種菌のカーペット培養液を調製した． 抗生物質ディスク（HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, India）を以下の割合で使用した。 アモキシシリン（10μg）、アジスロマイシン（10μg）、アミカシン（30μg）、アズトレオナム（30μg）、セフォキシチン（30μg）、セフタジジム（30μg）、シプロフロキサシン（5μg）。 imipenem（10μg），piperacillin/tazobactam（100/10μg），ertapenem（10μg），meropenem（10μg），cotrimoxazole（25μg）およびcefepime（30μg）． 接種したプレートは37℃で18時間まで好気的に培養した。 十分な培養後，ディスクの周囲のZOI（Zone of Inhibition）を測定し，その結果を感受性，中間性，耐性に分類した21。異なるクラスの3種類以上の抗生物質に耐性を示す分離株は，多剤耐性と解釈された22。

Screening for AmpC β-Lactamases

分離菌はまずCLSI guidelines, 2019に従ってAmpC β-lactamases 産生の可能性についてスクリーニングされた。23 スクリーニングには、セフタジジムまたはセフォタキシムまたはセフォキシチンまたはセフトリアキソン、それぞれ30μgをAST試験にかけ、これらの抗生物質に耐性のある生物（直径≦18mmの阻止域を示す）をAmpC産生の可能性としてスクリーニングし、さらに確認試験を受けた。

AmpCβ-Lactamasesの確認

スクリーニング陽性AmpCβ-Lactamases産生菌はAmpCディスクテストおよび阻害剤による確認試験（ボロン酸試験）により確認した。 セフォキシチン(30μg)ディスク2枚とフェニルホウ酸(400μg)を添加したディスク1枚をMHAプレート上のカーペット培養に置き、培養して結果を解釈した。 ディスク近似試験では，E. coli ATCC 25922のカーペット培養上にディスクを置き，フェニルホウ酸（400 μg）を添加したディスクと目的の抗生物質ディスクを組み合わせて評価し，併用しない場合（抗生物質ディスクのみ）より5 mm以上阻害域が増加すれば確認試験陽性の菌とした． セフタジジム30μg、イミペネム10μg、セフォキシチン30μg、アモキシシリン/クラブラン酸20/10μgをセフタジジジムから20mm離れた位置に配置した。 試験菌のコロニーをディスクに加えた後、プレートを反転し、37℃で24時間好気的にインキュベートした。 20,24

AmpC β-ラクタマーゼ陽性分離株の保存

保存にはグリセロールストック調製法を使用した． 25

Crude Plasmid DNA Extraction

試験菌の分離コロニーをLuria Bertani (LB) brothに植菌し、LBブロスで保存した。 この接種物をウォーターバスシェーカーを用い、37℃で18〜24時間好気的に培養した。 こうして得られた純粋培養物をアルカリ分解法にかけ、プラスミドDNAを抽出した。 26

AmpC β-Lactamase遺伝子（blaCITMとblaDHAM）のPCRによる増幅

AmpC β-Lactamase遺伝子（blaCITMとblaDHAM）はプラスミドDNAを鋳型としてPCRにより増幅された。 blaCITM遺伝子に用いたプライマーはCLR5-F（5ʹGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ）およびCLR5-R（5ʹ-CCA GAA -3ʹ）である。 BlaDHAM遺伝子のプライマーは、フォワード配列DHAM for（5ʹAAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ）とリバース配列DHAM_rev（3ʹCCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ) であった。）11 1X master mix（5×HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estonia）12.5μL, フォワードプライマーおよびリバースプライマー各 0.5μL, DNA テンプレート 4μL, ddH2O 7.5μL を加えて反応量を25μLとした。 両遺伝子のPCR増幅は、94ºCで3分間の初期変性、94ºCで30秒間の変性を35サイクル、62ºCで30秒間のアニーリングを25サイクル、72ºCで1分間の伸長を35サイクル、72ºCで7分間の最終伸長を最適化した11、27

Purification of DNA

プラスミドDNAはエタノール沈殿法で精製した。 この方法では、DNAペレットを氷冷した70%エタノールで洗浄し、10分間放置して乾燥させることで、アルコールの蒸発を促した。

ゲル電気泳動によるPCR産物の検出

0.1μL ethidium bromideで染色した1.5%アガロースゲルでゲル電気泳動し、増幅産物を可視化した。 ゲル調製後、最初のウェルにマーカーとして100bp DNA ladderを2μL、別のウェルにネガティブコントロールを2μL、別のウェルにポジティブコントロールを2μL、残りのウェルにPCR産物を2μL添加し、電気泳動した。 28

Quality Control

本研究の手順では、標準的な無菌手順を採用した。 培地および化学試薬のすべてのバッチは、CLSIガイドラインに従って無菌技術で処理された。 ASTでは，大腸菌ATCC 25922のコントロール株を用いて品質管理を行った。 PCRでは、問題の両遺伝子を持つKlebsiella株を使用することで品質管理を行い、核酸を適用しないブランクまたは陰性対照を調製した。 これらのコントロールはすべて、PCRアッセイの各バッチで使用された。

Statistical Analysis

データはSPSSソフトウェアバージョン24.0を使用して入力および分析された。 9353>

結果

Demographic and Clinical Character of Enrolled Patients

登録された1151人の患者のうち、54.2% (624/1151) は男性、45.8% (527/1151) は女性であった。 253人の細菌増殖のうち，47.8％（121/253人）は男性，52.2％（132/253人）は女性であった。 253件のうち，26.1％（66/253）が尿由来であり，次いでカテーテル先端（17.4％；44/253），血液（16.2％；41/253），膿（11.9％；30/253）および創傷スワブ（10.7％；27/253）由来であった． 年齢別では，16～45歳（39.5％，100/253）が最も多く，次いで46～60歳（30.1％，76/253），＜6803＞60歳（24.1％，61/253），0～15歳（6.3％，16/253）であった（Table 1）．

Table 1 Annapurna Neurological Institute and Allied Sciencesに通院する患者の人口動態と臨床特性

臨床検体における細菌分離の分布

合計1151件の臨床検体が対象となります． 22％（253/1151） が培地上で発育を示した。 253株のうち大部分（89.3％；226/253株）はグラム陰性菌であった。 増殖した細菌のうち，大腸菌（28.5％；72/253）が優勢で，次いで緑膿菌（16.2％；41/253），Acinetobacter baumannii（15.8％；40/253），Gram-positive bacteria（10.7%；27/253）， Klebsiella pneumoniae（9.9%；25/253），Clebsiella oxytoca（4.7％；12/253）であった（図1）

図1 文化陽性臨床検体における細菌属の分布（n=253)．

分離されたグラム陰性菌の抗生物質感受性パターン

グラム陰性菌226株中、66.8％（151/226），ceftazidime（58.4％； 132/226），ciprofloxacin（53.5％； 121/226），cefepime（51.5％）がそれに続いた。8％； 117/226）に対し，メロペネム（69％；156/226），ertapenem（68.6％；155/226），imipenem（66.8％；151/226），アミカシン（61.1％；138/226），piperacillin/tazobactam （56.6％； 128/226）およびazithromycin（53.1％；120/226）であった（表2）。

Table 2 Gram-Negative Bacterial Isolates（n=226）の薬剤感受性パターン

分離菌の多剤耐性（MDR）パターン

226株中46.9％（106/226 株）がMDRであった。 MDRの割合が最も高かったのは大腸菌（31.1％；33/106株）で，次いで緑膿菌（20.8％；22/106株），A. baumannii（18.9％；20/106 株），K. pneumoniae（9.4%；10/106 株），K. oxytoca（4.7%；5/106 株）と続いた（Figure 2）。 個々の菌種では，C. freundii（100％；8/8）が最も多剤耐性率が高く，次いでP. aeruginosa（53.6% 22/41），C. koseri（50％；2/4），A. baumannii（50％ 20/40），E. coli（45.8% 33/72）であった（Figure 2）．

図2 MDR菌の分布と全体のMDR %および各菌種内のMDR

AmpC Detection by Various Tests

Gram-negative 226株のうち50%（113/226）がセフォキシチンに対する耐性を有している． AmpCβ-lactamase産生株はDisk testとBoronic acid testの2種類の確認試験で確認した。 その結果，91株中91.2％（83/91）が両試験で陽性，8.8％（8/91）がボロン酸試験でのみ陽性であり，少なくとも1つの試験で確認された菌株をAmpC β-lactamase産生菌と判定した．

AmpCβ-Lactamase産生グラム陰性菌におけるblaCITMおよびblaDHAM遺伝子の陽性率

PCR法では90.1％（82/91）および87.91％（80/91）がblaCITMおよびblaDHAMに陽性であった．

図3 PCR産物の分離に用いたアガロースゲル電気泳動（1.5%）． Lane 2, positive control; Lane 3, 5, and 7 is CITM positive; Lane 4 and 6, CITM negative; and Lane 8. negative control.

Figure4.アガロースゲル電気泳動 (1.5 %)はPCR生成物の分離に使用される。 レーン2、陽性対照、レーン3、4、6、7はDham陽性、レーン5はDham陰性、レーン8は陰性対照。

Distribution of AmpC β-Lactamase, blaCITM and blaDHAM Genes Among Gram-Negative Isolates and Their Relationship to Gender, Age, Clinical Specimens and Clinical Isolates

91 AmpC producedのうち，女性からの分離は50.6% (46/91), 男性からの分離は49.4% (45/91) であった． また，BlaCITM遺伝子は男女とも同率（50％；41/82）で検出され，BlaDHAM遺伝子は男女ともそれぞれ51.3％（41/80），48.7％（39/80）検出された． また，患者の性別とAmpC酵素およびAmpC遺伝子の産生量との間に有意な相関は認められなかった（表3）．

Table 3 Gram-Negative Bacterial IsolatesにおけるAmpC β-Lactamase，CITM，DHAM Genes分布と性，年齢および検体の関連

AmpC β-lactamase production者の数は40.8人と最も多く（40.7％；37/91），BlaCITM（40.2％；33/82），BlaDHAM（41.2％；33/80） の産生株は，それぞれ年齢層（46～60歳）で得られ，次に（16～45歳）（30.8％；28/91），（ 29.3%；24/82），31.3%；25/80） であった． AmpCβ-lactamase産生量と年齢には有意な相関が認められたが（p＝0.01），BlaCITMおよびBlaDHAM遺伝子の取得など他の因子には年齢との有意な相関が認められなかった（表3）．

臨床検体では，AmpCβ-lactamase産生株が血液およびカテーテル先端部から最も多く（20.9％：19/91），次いで尿（18.7％：17/91），膿（13.3％：12/91），傷口スワブ（9.9％：9/91）であった。 同様に，BlaCITMおよびBlaDHAM産生株は，カテーテルチップ（21.9％；18/82）；（22.5％；18/80）から最も多く検出され，次いで血液（19.5％；16/82）；（21.3％；17/80）尿（17.0％；14/82）；（17.5％；14/80）膿（13.4％；11/82）；（8.8％；7/80）であった． 臨床検体，AmpCβ-lactamase産生量，遺伝子：BlaCITM，BlaDHAMの間に有意な関連は認められなかった（表3）．

各種グラム陰性菌におけるAmpC β-ラクタマーゼの分布とblaCITMおよびblaDHAM遺伝子の取得

AmpCβ-ラクタマーゼ酵素の保有率が最も高かったのはE. coli（28.6％； 26/91），次いでP. aeruginosa（26.4％； 24/91），A. baumannii（13.2％； 12/91），K. pneumoniae（10.9％； 10/91）の順となり，AmpCβ-lactamase酵素の陽性率が高かった。 blaCITMおよびblaDHAM遺伝子は，大腸菌（30.6％；25/82）（31.3％；25/80）で最も多く検出され，次いでP. aeruginosa（25.7%；21/82），（22.5%；18/80）A. baumannii（12.2%；10/82），（12.4%；10/80）K. pneumoniae（10.9%；9/82），（12.4%；10/80) が続いた（表3）．

考察

抗菌薬耐性の増加は、ネパールのような発展途上国における主要な公衆衛生問題の1つとして残っており29、入院期間の延長、治療費の増加、治療方法の制約、罹患率と死亡率の増加につながっています29,30。 β-ラクタム系抗生物質に対する主な防御機構は、β-ラクタマーゼの産生である。 本研究は，ネパールのカトマンズにあるANIASで得られた臨床検体から得られたグラム陰性菌におけるAmber Class C β-lactamases（AmpC）の存在を調べるために実施された。 さらに，AmpCβ-lactamase遺伝子（blaCITMおよびblaDHAM）のPCR法による検出率を評価した． その結果，これらの酵素や遺伝子の有病率は，地域や国によって異なるものの，高い値を示した。

1151件の臨床検体のうち，有意な菌の増殖を認めたのは253件（21.9％）であった． 合計（253個）の細菌増殖のうち、90％以上はグラム陰性菌で、その中で最も優勢だったのは大腸菌であった。 この結果は、Everest Hospital, Baneshwor、14 Alka Hospital, Jawlakhel、31 National Public Health Laboratory, Teku、32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa、33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan、34 Nobel Medical College, Biratnagar、35 New Delhi, India、36 Al-Najaf City, Iraq、37 Shashemene Referral Hospital, Ethiopia、38 および Mexico City, Mexicoで報告されてきた先行研究39とも整合的であった。 グラム陰性菌感染症は女性患者でやや高い割合で観察されたが、これは女性で尿路感染症の有病率が高いためと思われる。 この結果は、カトマンズのモデル病院17およびインドのアンドラプラデシュで行われた先行研究と一致している。41 インドのウッタルプラデシュ州で行われたある研究では、術後症例の膿の感染率が男性（43.75％）よりも女性（63.33％）で高いことが報告された。

本研究では，グラム陰性菌はcefoxitin, ceftazidime, ciprofloxacin, cefepime, cotrimoxazoleに高い耐性を示し，meropenem, imipenem, piperacillin-tazobactam, azithromycinが最も感受性が高い抗生物質として報告されている。 セフォキシチンとセフタジジムの感受性の低さは，細菌酵素によって容易に加水分解され，グラム陰性菌による感染症の治療にはあまり有用でない第一線の薬剤であることを示している。 本研究と同様に，カトマンズのモデル病院，スペインのマドリッド，アメリカのウィスコンシンでの先行研究では，イミペネム/メロペネムが最も感受性が高いことが判明した45

MDRの広がりを伴う抗菌薬耐性（AMR）は世界的に懸念されており，その影響は感染症負担の高い低・中所得国でより高くなっている30． 本研究では，分離されたグラム陰性菌のほぼ半数（46.9％；106/226）がMDRであることが確認された． ESBL，metallo β-lactamase（MBL）またはAmpC β-lactamaseの産生が，新世代の抗生物質に対する感受性を低下させる原因である可能性がある52． さらに，多剤耐性は耐性プラスミド上の異なる遺伝子や多剤排出ポンプをコードする遺伝子の凝集・発現により生じる53。また，β-ラクタマーゼ酵素の発現を担う遺伝子はアミノグリコシドやフルオロキノロンなどの非β-ラクタム系抗生物質に常に関連している

本検討ではAmpC生成量は女性より男性で多く（41.67％）認められた38.98％である． 本研究の結果は，ナイジェリア北西部のカノで行われた他の研究結果と一致している54が，本研究の結果はナイジェリアのベニンで報告された研究結果とは異なっていた55．多くの研究で，多剤耐性UTIは女性で多く報告されており，これは，男性よりも女性の方がUTIにかかりやすく，AmpC生成菌が多いためかもしれない。 さらに、このマーカーは良好な陰性的中率を提供する。

その広い範囲にもかかわらず、いくつかの研究では、AmpC産生のスクリーニング剤としてcefoxitinの使用は不十分であると強調されている。 これは，AmpC産生以外のメカニズム（ポリンチャネルの変異など）が存在するため，cefoxitin耐性と誤判定してしまうためと考えられる52。 この結果は，カトマンズのモデル病院における研究と対照的であった17．この違いは，表現型検出法がcefoxitin抵抗性試験とcefoxitin（30 μg）を用いたAmpCディスクテスト法であったためであると考えられた． 確認試験として，cefoxitin 30μg/400μg phenylboronic acidを用いたphenylboronic acid testを実施し，cefoxitin 30μg/400μg phenylboronic acidを用いたphenylboronic acid testを実施した。 ボロン酸誘導体はAmpCβ-lactamase酵素の可逆的阻害剤として証明された56

本研究では，113株中91株（80.53％）でAmpC産生が確認され，AmpCβ-lactamase酵素の可逆的阻害剤と考えられた． 本研究におけるAmpC産生率は，Model Hospital, Kathmandu，17 Chitwan Medical College，57 Bharatpur, Chitwan，58 and Indiaで報告された他の研究よりもやや高い59

一方の手法による限界を補うために，日常診断において両方の手法を統合すれば臨床現場での検査の感度と特異性を高めることができる。 本研究では，AmpC関連遺伝子（BlaCITMおよびBlaDHAM）の発現状況を表現型および遺伝子型別で検討した結果，BlaCITMおよびBlaDHAMがより多く発現していた． 本研究により，臨床分離株におけるAmpCβ-lactamase産生に関連するグラム陰性菌とその薬剤感受性パターンを広く解析することができた。 本研究で得られた知見は，様々な菌のセファロスポリンに対する耐性パターンを知る上で重要である。 ESBL，MBL，AmpC 産生を含むβ-ラクタマーゼを有する多剤耐性菌のサーベイランスは，治療の最適化とβ-ラクタム系抗生物質の耐性化防止のために日常臨床で必要である13, 61, 62．

長所と短所

本研究は、ネパールの3次医療センターに通院する患者を対象に、表現型と分子検査の両方を用いてAmpCβ-ラクタマーゼ遺伝子（blaCITMとblaDHAM）を調べた初めての研究である。 本研究で得られた知見は，病院感染症の管理，治療プロトコル，診断方法の準備など，3次医療施設における抗菌薬政策に反映させることが可能である。 本研究は，AmpC β-lactamasesが限定的であること，研究期間が短いこと，単一の3次医療施設で実施されたことなどから，いくつかの制約がある。 今後は，ESBL，MBL，KPCなどすべてのβ-lactamasesと主要な耐性遺伝子について，複数の3次医療施設で縦断的な研究を行うことが可能である。 しかし，表現型と分子的手法の三位一体による初めての研究として，本研究はネパールの他の環境／病院におけるAmpC β-lactamasesとBlaCITMおよびBlaDHAM遺伝子の有病率に関する今後の研究にとって貴重な参考となるであろう。 AmpCβ-ラクタマーゼ産生菌を正確に検出するためには，単一の決定的な方法がないため，複数の表現型検出方法を同時に利用することが提案された。 本研究では，PCR法により表現型が確認された分離株のほぼ90％のAmpCβ-lactamase遺伝子（blaCITMおよびblaDHAM）が検出された。 このようにグラム陰性菌の耐性遺伝子やMDRが多いことは憂慮すべきことであり，これらの菌の増殖や拡散を抑制するための緊急的な介入が必要である。