ISH: in situ hybridization protocol

Sample storage

RNA preservation
RNase enzymeの存在により、RNA保存が困難となることがあります。 この酵素は、ガラス器具、試薬、オペレーターやその衣服に付着しています。 RNaseは細胞内のRNAやRNAプローブそのものを速やかに破壊してしまうため、プローブや組織RNAにRNaseが付着しないよう、滅菌処理、手袋、溶液を使用する必要があります。 代わりに、100%エタノール中、-20℃、またはサランラップで覆われたプラスチックボックス中、-20℃または-80℃で保管する。

Choice of probe

RNA probes

RNA probeは250-1500 baseの長さが望ましく、約800 baseの長さが最も感度と特異性に優れている。 転写テンプレートは、プローブ（アンチセンス鎖）とネガティブコントロール（センス鎖）の両方のRNAを転写できるようにする。 そのためには、opposable promoterを持つベクターにクローニングする。

DNA probes

DNA probesはin situ hybridizationに高い感度を提供する。 RNAプローブに比べ、ターゲットとなるmRNA分子にはあまり強く結合しないので、ハイブリダイゼーション後の洗浄にはホルムアルデヒドを使用しない方が良い。

プローブの特異性は重要である。 細胞内のmRNAやDNAの正確なヌクレオチド配列がわかっていれば、正確な相補的プローブを設計することができる。 もし、>5%の塩基対が相補的でない場合、プローブは標的配列に緩くしかハイブリダイズしない。 このことは、プローブが洗浄や検出のステップで洗い流されやすく、正しく検出されない可能性があることを意味する。

Digoxigenin (DIG)-labeled RNA probe in situ hybridization protocol

This protocol is the use of DIG-labeled single-stranded RNA probes to detect the interest of the paraffin embedded sections.

1) Deparaffinization

For frozen sections, start at Step 2.からスタート。 ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋切片を使用する場合は、このステップに進みます。

次に進む前に、スライドは脱パラフィンと再水和が必要です。 パラフィンの除去が不完全だと、切片の染色性が悪くなることがあります。

スライドをラックに入れ、以下の洗浄を行います。

• Xylene: 2×3 min
• Xylene 1:1 with 100% ethanol: 3 min
• 100% ethanol: 2×3 min
• 95% ethanol.Xml
• 100% エタノール
• 95% エタノール

  Slides of the spinad: 1 x 2 min

• 70 % ethanol: 3 min
• 50 % ethanol: 3 min
• Rinse with cold tap water

抗原賦活までスライドは水道水につけておいてください。 この時点からスライドは乾燥させないようにしてください。非特異的な抗体結合やバックグラウンドの高い染色の原因となります。

2) 抗原回収

あらかじめ温めた50 mM Tris中、20 µg/mL proteinase Kで37℃、10～20分消化します。 インキュベーション時間とProteinase K濃度の最適化が必要です。

最適な条件を決定するために、Proteinase Kの滴定実験を行うことをお勧めします。 消化が不十分だとハイブリダイゼーションシグナルが減少し、消化しすぎると組織の形態が悪くなり、ハイブリダイゼーションシグナルの局在が非常に難しくなります。 最適なproteinase K濃度は、組織の種類、固定期間、組織の大きさによって異なります。

3) スライドを蒸留水で5回リンスする。
4) スライドを氷冷した20% (v/v) 酢酸に20秒浸漬する。
5) 70%エタノール、95%エタノール、100%エタノールで1回あたり約1分間洗浄し、自然乾燥する。
6) 各スライドに100 µLのハイブリダイゼーション溶液を加える。

塩溶液（20x）

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7.5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Denhardt’s solution (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polyvinylpyrrolidine)
• 10 g bovine serum albumin (BSA)

10 g BSA (BSA) 10 g Ficoll 10 g PVP 10 g BSA 500 mL sterile dH2O

7) スライドを加湿したハイブリダイゼーションチャンバー内で1時間インキュベートし、希望のハイブリダイゼーション温度で培養する。
8) PCRチューブに入れたハイブリダイゼーション溶液でプローブを希釈する。 PCRブロック内で95℃、2分間加熱し、RNAまたはDNAプローブを変性させる。 再アニーリングしないようにすぐに氷上で冷やす。
9) ハイブリダイゼーション溶液を排出する。 希釈したプローブを1セクションあたり50～100μL加え、サンプル全体に行き渡るようにする。 加湿されたハイブリダイゼーションチャンバーで65℃、一晩インキュベートする。

このステップで、RNAプローブは対応するmRNAに、DNAプローブは対応する細胞DNAにハイブリダイズする。 使用するプローブの配列や、細胞や組織の種類によってハイブリダイゼーション温度を最適化する。 この温度は、分析する組織タイプごとに最適化する必要があります。

プローブの最適なハイブリダイゼーション温度は、ターゲット配列に存在する塩基の割合に依存します。 配列中のシトシンとグアニンの濃度は重要な因子である。

10) Stringency washing

温度、塩、洗剤濃度などの溶液パラメータは、非特異的相互作用を取り除くために操作できる。

20x saline sodium citrate (SSC) 1 Lを準備する

• 175.3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g クエン酸ナトリウム
• 800 mL sterile dH2O
• クエン酸でpH 5に調整、1 Lに充填しオートクレーブ

Wash 1

• 2x SSC
• 3×5 min.で50%ホルムアミドを使用。 37-45°C

余分なプローブやハイブリダイゼーションバッファーは、高温（65℃まで）で短時間で洗い流してください。

Wash 2

• 0.1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

このステップにより、非特異的かつ/または反復的にハイブリッドしたDNA/RNAを除去することができます。

Follow these guidelines to optimize temperature and salt concentration for stringency washes:

• For very short DNA/RNA probes (0.).5-3 kb）または非常に複雑なプローブの場合、洗浄温度は低く（45℃まで）、ストリンジェンシーは低く（1-2x SSC）すべきです。
• 単座または大きなプローブでは、温度は約65℃、ストリンジェンシーは高く（0-0.5℃以下）すべきです。

11) MABT（Tween 20を含むマレイン酸バッファー）で30分、室温で2回洗浄する。 MABTはPBSより優しく、核酸検出に適しています。

5x MABTストックの調製

• 58 g maleic acid
• 43.5 g NaCl
• 55 g Tween-20
• 900 mL water

Tris baseを加えpH 7.5 まで上げる。 約100gが必要です。 最終的に1Lにします。

12) スライドを乾燥させます。
13) 加湿器に移し、各セクションに200μLのブロッキングバッファー（MABT＋2％BSA、牛乳または血清）を加えます。 室温で1～2時間ブロッキングします。
14) ブロッキングバッファーを排出します。 ブロッキングバッファーに必要な希釈率で標識抗体を添加します。 推奨濃度/希釈率については抗体データシートを参照してください。
15) MABTでスライドを5×10分間、室温で洗浄する。
16) プレ染色バッファ（100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2）でスライドを2×10分間ずつ、室温で洗浄する。） 蛍光検出の場合は、Step18に進みます。 その他の検出方法については、スライドを加湿器に戻し、製造元の指示に従って発色させてください

18) 蒸留水でスライドをすすぎます。
19) スライドを30分間自然乾燥させる。 100%エタノールで洗浄し、十分に風乾する。
20) DePeXマウント液でマウントする。