Before It Gets Started: 翻訳を制御する5′UTR

Abstract

翻訳制御は正常な生理状態でも疾患状態でも重要な役割を担っている． この制御には，主に5′と3′UTRに存在するシス制御因子と，特定のRNAの特徴を認識し翻訳機と相互作用してその活性を調節するトランス制御因子（例えば，RNA結合タンパク質（RBPs））が必要である。 この論文では、uORF（上流オープンリーディングフレーム）、二次構造、RBPs結合モチーフなど、この領域に存在する主要要素の特徴や機能、翻訳制御のさまざまなメカニズム、およびそれらが制御されない場合に遺伝子発現や人間の健康に与える影響について概観することによって、5´UTRが媒介する制御の重要性について論じる

1. 翻訳制御

遺伝子発現は、クロマチン修飾からmRNAの翻訳まで、複数のレベルで調節することができる。 転写調節の重要性にもかかわらず、mRNAレベルを細胞のタンパク質含有量を正当化する唯一のパラメーターとして使用できないことは、この時点で明らかである。 実際、私たちの研究室が最近行った研究では、ヒトの細胞株で解析した遺伝子のうち、mRNAとタンパク質の間に直接的な相関関係が存在するのは3分の1以下であることが判明しました。 さらに、5′UTR、3′UTR、コーディング配列の長さ、uORFの存在、アミノ酸組成など、翻訳に関連するいくつかのパラメータが、得られたmRNA/タンパク質比と良い相関を示したことから、翻訳制御がタンパク質の変動に大きく寄与していることが示唆された。 翻訳制御は、内外の刺激に応答して遺伝子発現の急激な変化が必要な場合に重要なスイッチとして機能する（PDGF2、VEGF、TGFβはそのように制御されている遺伝子の例である）。 翻訳制御もまた、発生や細胞分化の過程で、転写物の大部分は変化しないまま、特定の時間枠の中で特定のmRNAサブセットの発現レベルを変化させることにより、重要な役割を果たしている（総説あり）

この論文では、5′UTRによる制御の重要性とこの領域に存在する異なる機能要素（IRESはこの号の別の記事で論じる）に焦点を合わせることにします。 5′ UTRの主な制御要素は、二次構造（IRESを含む）、RNA結合タンパク質の結合部位、uAUGs、uORFsである（図1）。

2. 5′ UTR

5′ UTR の平均長は、種を超えて 100 から 220 ヌクレオチド程度である。 脊椎動物では、転写因子、癌原遺伝子、成長因子とその受容体、および通常の条件では翻訳が不十分なタンパク質をコードする転写産物では、5′UTRが長い傾向にある。 また、GC含量が高いことも保存されている特徴であり、温血動物の場合、その値は60％を超えている。 ヘアピン構造の場合、GC含量はヘアピンの熱安定性やヘアピンの位置とは無関係に、タンパク質の翻訳効率に影響を与える可能性がある。 真核生物のmRNAのUTRには、short and long interspersed elements (SINEs and LINEs, resp.), simple sequence repeats (SSRs), minisatellites, macrosatellitesなどの様々なリピートがあります。

真核生物の翻訳開始には、5-m7Gキャップ構造のいずれかでリボソームのサブユニットを動員することが必要です。 開始コドンは一般にずっと下流に位置し、この部位にリボソームが移動する必要がある。 この移動は、いくつかのmRNAでは非線形であるように見える（すなわち、リボソームサブユニットがAUGの方向に移動する際に、5′UTRのセグメントを迂回（シャント）しているように見える）。 シャントすることにより、uAUGやヘアピン構造を持つmRNAを効率的に翻訳することができるようになるかもしれません。 カリフラワーモザイクウイルスやアデノウイルスのmRNAがその重要な例である。 リボソーム・シャントのメカニズムは、mRNAとrRNAの塩基対形成が必要であり、かなり複雑である。 10-18％の遺伝子が複数のプロモーターを用いて代替的な5′UTRを発現し、UTR内の代替スプライシングは哺乳類のトランスクリプトーム中の13％の遺伝子に影響を与えると推定される。 これらの5′UTRのバリエーションは、遺伝子発現を制御する重要なスイッチとして機能することができる。 二つの重要な例は、癌関連遺伝子BRCA1（乳癌1）とTGF-β（トランスフォーミング成長因子β）である。 BRCA1は乳癌で頻繁に変異する癌抑制因子で、細胞周期、アポトーシス、DNA損傷修復に機能する。 BRAC1は、2つの異なるプロモーターに由来する2つの異なる転写産物を生成し、したがってその5′UTRに違いが見られる。 短い方の転写産物は癌および非癌の乳房組織で発現し、効率よく翻訳されるが、長い方の転写産物は乳癌で優勢に発現する。 いくつかのuAUGの存在と、より複雑な構造が、この長い転写産物の翻訳に劇的に影響する。 このため、腫瘍細胞内のBRAC1レベルが全体的に低下し、増殖抑制が緩和される。 TGF-βは、細胞増殖、移動、創傷修復、発生、腫瘍形成および免疫抑制を含む多くのプロセスに関与している。 3つのアイソフォームが知られている：β1、β2、およびβ3。 TGF-β3は2つの転写産物を生成する：非常に長い5′UTR（1.1kb）を持つ3.5kbの転写産物と、より短い5′UTR（0.23kb）を持つ2.6kbの転写産物である。 長い方の転写産物には11個のuORFが存在し、その翻訳は劇的に阻害されるが、短い方の転写産物は効率的に翻訳される。 二次構造による制御

5′UTR において二次構造は主要な制御ツールとして機能することができる。 遺伝子の機能との相関が示唆されている。二次構造は、転写因子、プロトン遺伝子、成長因子、およびそれらの受容体をコードするmRNAや、通常の条件下では翻訳されないタンパク質に特に多く存在することが明らかにされている。 >これらのクラスの転写産物の90%は、平均自由エネルギーが-50 kcal/mol以下の安定した二次構造を含む5′UTRを持っています。これらの安定した二次構造の60%はキャップ構造の非常に近くに位置しています。 これらの構造は、翻訳を阻害するのに非常に効果的である。 実際、キャップに近い位置にあるヘアピンの自由エネルギーは-30 kcal/molであり、プレイニシエーション複合体がmRNAに到達するのを阻止するのに十分である。 一方、5′UTRから離れた場所にあるヘアピンは、翻訳を阻害するために-50 kcal/mol以上の自由エネルギーが必要である。 安定した二次構造は、ヘリカーゼelF4Aの巻き戻し活性に抵抗することができる。 この効果は、elF4Bと協力してelF4Aを過剰発現させることで部分的に克服できる。がん原遺伝子や他の成長因子のように高度な構造を持つ5′UTRのmRNAは、キャップ依存性の翻訳開始を利用している。 当然ながら、elf4Eを含む翻訳開始機構の構成要素の過剰発現は腫瘍形成に関連している（総説あり）。

TGF-β1遺伝子は、二次構造によって仲介される翻訳阻害の好例である。 5′UTRの進化的に保存されたモチーフは、安定したステムループを形成している。 しかし，この構造だけでは翻訳を阻害するのに十分ではない。 TGF-β1の翻訳抑制は、RNA結合タンパク質YB-1のTGF-β1転写物への結合が増加することに依存している。 そして、YB-1がTGF-β1の5′UTRにGC含有のおかげで高い親和性で結合し、幹ループと協力して二重鎖形成を促進することによってTGF-β1の翻訳を阻害することが提案された。 RNA結合タンパク質による制御

ヒトゲノムには約1000のRNA結合タンパク質（RBPs）がコードされていて、それらの大部分が翻訳に関係していると予測される。 これらは大きく2つのグループに分類される。 基本的な翻訳機構の一部であり、すべての発現mRNAの翻訳に必要なRBP（例：PABPI、elf4E）と、特定の標的mRNAの翻訳レベルを正または負に制御することでより選択的に機能するRBP（例：HuR、Musashi1）である。 この後者のグループに関しては、RBPは異なるメカニズムで翻訳を増加させたり抑制したりすることが観察されている。 いくつかの例外はあるが、RBPはUTRの特定のモチーフを認識し、翻訳装置と相互作用して発現を制御することが多いと言える。 翻訳への干渉は通常開始段階で行われる（総説あり）。

5′ UTRが関与するRBP媒介制御の最も特徴的な例は、鉄制御タンパク質（IRP1及び2）によって提供される。 これらのタンパク質は、鉄応答要素（IRE）として知られる、約30ヌクレオチドの高度に保存された幹ループ構造を認識する。 最も重要な特徴は、CAGYCX（Y=UまたはA、X=U、CまたはA）という配列を持つ6塩基ループと、不対になっているシトシンによって長さの異なる下部ステムと分離している5bpの上部ステムである。 フェリチン、ミトコンドリアアコニターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ-鉄タンパク質、赤血球5-アミノレブリン酸合成酵素（eALAS）、フェロポーティン（FPN1）という鉄輸出分子など、鉄貯蔵・代謝に関わる多くのmRNAがこのシステムによって発現調節されており、細胞の鉄ホメオスタシス維持に重要であることが分かっている。 IRP1とIRP2は、細胞内の鉄濃度が低いときにIREに結合し、下流のORFの翻訳を阻害する。 細胞内の鉄レベルが高いときには、両IRPのRNA結合活性は低下する（図2(a)）。 IREはキャップの近くに位置する傾向があり、40Sリボソームサブユニットの転写産物への結合を立体的に阻害する原因となる。 キャップから遠い位置にある場合、IRE-IRP複合体は40Sのリクルートメントに影響を与えるのではなく、リボソームのスキャンを阻害する（レビューあり）。 IRE/IRP機構の興味深いバイパスは、鉄飢餓状態の十二指腸や赤血球の前駆細胞で観察することができる。 上流プロモーターは、IREの3′にあるスプライスアセプターに代替スプライシングによって接続された、もう一つのエキソンを含むFPN1プレmRNAを生成するために使用される。 同じオープンリーディングフレームを含む成熟FPN1転写物が生成される；しかしながら、5′UTRはIREを含まない。 従って、これらの細胞は鉄非依存的に代替FPN1アイソフォームを発現する。 IREに影響を与える変異は、疾患の原因となることがある。 これは遺伝性高フェリチン血症白内障症候群（HHCS）のケースであり、水晶体におけるフェリチンの凝集と結晶化が両側白内障を引き起こす常染色体優性遺伝性疾患である。

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(b) 図2

RBPを介した調節は非常に精巧で複数の段階を含むことがある。 因子間のクロストークと異なる制御過程を示す好例として、投与量補償の主要な担い手であるショウジョウバエの雄特異的致死2（msl-2）遺伝子がある。 雌性特異的RNA結合タンパク質sex lethal（SXL）は、msl-2の発現を阻止する必要があるmsl-2制御の様々な側面に関与している（図2（b））。 制御はスプライシングレベルで始まる；SXLは5′UTRの一部であるイントロンに位置する2つのポリUストレッチに結合する。 このプロセスによりイントロンが保持され、後に翻訳制御に使用される重要な配列が保存される。 細胞質では、同じSXLタンパク質が、3′UTRと5′UTRで起こる2つの異なるメカニズムで、msl-2の翻訳抑制因子として機能することになる。 SXLは3UTRのU-リッチ配列に結合し、コアプレッサータンパク質UNR（N-rasの上流）とPABPをリクルートして、プレ開始複合体のmRNAの5末端へのリクルートをブロックしている … msl-2が完全に抑制されるようにするために、SXLが仲介する第2の制御ステップが5′UTRで行われる。 この抑制には、SXLとuORFの間のクロストークが起こり、効率的に翻訳を抑制するという新しい制御メカニズムが関与している。 msl-2の5′UTRには3つのuORFが存在するが、3番目のuORFのみが翻訳抑制に関与していることが明らかになった。 興味深いことに、この抑制はSXL非存在下では非常に弱いが（〜2倍）、SXLが存在すると、uAUGから数塩基離れたポリUストレッチに結合し、この抑制を14倍以上にまで高めることができる。 SXLは、uAUGでの翻訳開始を促進することによって作用し、走査リボソームの単純な立体的阻止として作用するのではないことがわかった。 この効果は、SXLと翻訳開始因子（ツーハイブリッドスクリーニングで示されたように、おそらくelF3構成因子のメンバー）との相互作用を介して起こる可能性がある。 このメカニズムは、多くのmRNAに影響を与える可能性がある。ショウジョウバエの268の転写産物は、適切な間隔で配置されたuAUGに関連するSXL結合モチーフを含むと決定された。 例えば、 Irr47という遺伝子の5′UTRを含むレポーター構築物は、SXLタンパク質によって4倍抑制された

RBPは翻訳を制御する際に拮抗する機能を持つことがある。 興味深い例として、細胞が不可逆的な成長停止状態に入る細胞状態である複製性老化の文脈におけるp21の制御が挙げられる。 このプロセスを開始し、cdk2-サイクリンE複合体を阻害するためには、p21の誘導が必要である。 p21の5′UTRにはGCリッチな配列があり、ステムループを形成している。 この要素は、異なる性質を持つ2つのRBPによって認識される。 CUGBP1とカルレティキュリン（CRT）である。 この2つのタンパク質間の競合により、p21の最終的な発現レベルが決定され、細胞が増殖するか、成長停止や老化を迎えるかが決定される。 CUGBP1のp21 mRNAへの結合は、若い線維芽細胞に比べて老化細胞で劇的に増加している。 タンパク質量は途中で変化せず、この活性の上昇はリン酸化によるものである。 一方、CRTのIPでは、老化細胞では発現量の減少により活性が4〜5倍に低下していることが示された。 両タンパク質とも、p21の翻訳に影響を与えることが示された。 しかし、CUGBP1が活性化因子として機能するのに対して、CRTは抑制因子として機能する。 この2つのタンパク質は、老化細胞において相反する活性を持つことから、p21 mRNAとの相互作用とその翻訳を制御するために競合するかどうかを検討した。 一方のタンパク質の量を増やすと、他方のタンパク質のp21 mRNAへの結合と翻訳への影響を逆転させることができた。結合部位への親和性はかなり異なり、CUGBP1がCRTに対して4〜8倍モル過剰で結合反応に存在しなければ、p21 mRNAへの結合とその翻訳に拮抗して影響を与えなかった

5. uORFとUpstream AUGによる制御

uORFとuAUGは5′UTRに存在する主要な制御要素である。 uORFはメインコード領域の上流にある開始コドンと停止コドンで定義される配列であり、uAUGはメインコード領域の上流にあるフレーム内下流停止コドンを持たない開始コドンである。 ヒトのトランスクリプトームの大部分はuORFおよび/またはuAUGを含んでおり、その値は44から49%の間です。 マウスのトランスクリプトームにも同様の数値が見られます。 uORFとuAUGは、転写因子、成長因子、その受容体、癌原遺伝子などの特定のサブグループに多く含まれています。 uORFとuAUGは、キャップやメインAUGとの位置関係、転写産物あたりの数、長さ（uORFの場合）などが非常に多様である。 補足表1（補足資料：オンライン版http://dx.doi.org/10.1155/2012/475731）に、ヒトのトランスクリプトーム中に存在するuORFとuAUGの包括的なリストを掲載しました。 ヒト、マウス、ラットの転写産物のサブセットを用いて行われたパイロット研究では、uORFの38%とuAUGの24%が3つの種の間で保存されていると決定され、両要素が中程度に保存されていることが示されました。 uORFの保存性が低いことと、uORFの平均長（20ヌクレオチド）が偶然予想されること、uAUGがuORFに比べて強い抑制力を持つことから、多くのuAUGが進化の過程で下流の停止コドンを獲得して中和されたことが示唆された。 そこで、ごく一部のuORF（保存されているもの）だけが、発現調節に利用されているのではないか、と提唱されている。 酵母では、uORFは5′UTRに統計的に存在せず、選択圧によって除去されたことが示されており、同様に残りのuORFが翻訳制御に関与している可能性を示している

これまで全体としてuORFはタンパク質生産と負の相関があるとされてきたが、限られた数のuORFとuAUGに対してのみ機能活性が証明されている。 図3では、uAUGが翻訳効率に与える影響の例を示している。 機能性に寄与し得る最も関連性の高い特徴は、長い5′cap-to-uORF距離、配列保存、AUGが位置するコンテキスト、ORFの開始サイトの強さ、uORFの長さ、5′UTRのAUGの数である 。 リボソームがuAUGやuORFに遭遇した場合、異なる結果が観察されている。 しかし、まだその数は少ないので、一般的なメカニズムを定義することは困難です。 リークスキャンとは、スキャン複合体の一部がuAUGやuORFを迂回して、次のAUGを探し続けることである。 この場合、上流のAUGはORFのAUGから「おとり」として働き、少なくとも一部のリボソームでは翻訳の負のレギュレーターとして機能する。 uORFによるシス作用ペプチドの生成は、uORFの末端でリボソームを停止させることにより、下流のORFの翻訳開始を減少させることができる 。 真核生物のアルギニンアテニュエーターペプチド（AAP）は、高アルギニン濃度において真菌類のアルギニン生合成に関与するタンパク質の翻訳を負に制御することが典型的な例である。 このシナリオでは、アルギニンがAAPのコンフォメーションやPサイト環境を変化させ、AAP uORFの終止コドンでリボソームのストール（失速）を引き起こす。 AAPはまた、uORFがコード配列内に挿入された場合にも、リボソームの失速によって翻訳伸長を低下させる。 uORFを介した制御のもう一つの典型的な例は、酵母から得られている。 転写因子GCN4の5′UTRには4つのuORFが存在する。 4つのuORFのうち最初のuORFは、栄養状態に関係なく常に効率よく翻訳される。 障害のない細胞では、リボソームと開始補因子の急速な再ロードにより、uORF2-4の翻訳が可能になる一方で、主要なORFの翻訳は抑制される。 アミノ酸飢餓の状況では、開始因子が不足し、リボソームの再ロードが減速し、uORFを含む配列の上を走査することになる。 機能的な開始複合体は、メインコード配列でのみ再集合され、GCN4が発現する。 この機構により、栄養ストレスに対する迅速な応答が可能になる。 uORFによる発現制御のもう一つの類似した例として、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1C (CPT1C)遺伝子がある。 CPT1Cは、エネルギーが過剰な状況下で、脳内の代謝を調節している。 5′UTRにuORFが存在すると、そのORFの発現が抑制される。 しかし、この発現抑制は、グルコース欠乏やパルミチン酸BSA処理などの特定のストレス刺激に応答して緩和される 。 uORF は mRNA の分解を誘導することもできることが示唆されている。 細菌トランスポゾン Tn9 由来の cat 遺伝子をレポーターとして含む一連の 5′UTR コンストラクトを酵母でテストした。 1塩基の置換でcat遺伝子の上流に7コドンのORFを作成した。 このuORFは効率的に翻訳され、cat ORFの翻訳阻害とcat mRNAの不安定化を引き起こした . また、uORFを含む転写産物と含まない転写産物の平均発現レベルの比較から、uORFとmRNAの崩壊の関連性も示唆された。

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(b)> 図3

タンパク質レベルを変化させてしまうuORFを排除または作り出すいくつかの変異が、ヒト疾患と関係していると言われている。 それらの関連性は最近議論されました 。 メラノーマの素因は、サイクリン依存性キナーゼ阻害タンパク質（CDKN2A）遺伝子の5′UTRにuORFを導入する変異によって引き起こされる可能性があります。 遺伝性血小板血症は、uORFを排除するスプライシングバリアントを作成する変異によって引き起こされ、遺伝子トロンボポエチンのタンパク質産生の増加をもたらす 。 Marie Unna遺伝性低毛症は、ヘアレスホモログ遺伝子の5′UTRに存在するuORFを破壊し、結果としてその発現を増加させる変異に由来する ………この変異は、ヘアレスホモログ遺伝子の5′UTRを破壊し、結果としてその発現を増加させる。 TGF-β3転写産物の5′UTRに存在するuORFの1つにおけるGからAへの移行は、不整脈原性右室心筋症／異形成（ARVC）に関連することが決定された . 生殖腺形成不全症（SRY）、Van der Woude症候群（IRF6）、Carney Complex Type 1（PRKAR1A）、遺伝性膵炎（SPINK1）、サラセミア-β（HBB）など、疾患に関連するuORFが、最近レポーターアッセイでテストされた。 このリストは、uORFを作成または削除する500以上の一塩基多型（SNPs）が報告されているので、確実に拡大すると思われる。 5′ UTRにおける新規制御要素の探索

ヒト5′ UTRに存在する転写後制御要素のごく一部のみが特徴づけられてきた。 これらの同定された UTR 要素は Graziano Pesole のグループが管理する UTRdb (http://utrdb.ba.itb.cnr.it/) と呼ばれるウェブリソースにカタログ化されている． UTRの転写後制御要素、特にRBPに関連する要素を同定するためのin vivo手法は、ディープシーケンス技術のおかげで過去5年間で劇的に進歩した。 CLIPやRIP-Seqは、免疫沈降法によるRNAタンパク質分子（RNP）の単離と、その後のRNase消化、ディープシーケンスによるRBP結合部位の精密同定に基づく手法である 。 これらの方法でこれまでに解析されたRBPの数は実に少ないが（総説あり）、深部配列決定技術がより利用しやすくなり、方法が単純化されれば、UTRにおけるヒトRBP結合部位の大部分が近いうちにマッピングされると予想される

翻訳を制御するUTR要素をマッピングするもう一つの選択肢として、UTR配列解析に基づく純粋な計算方法を使用する。 これらの方法は、RBP結合部位の予想される特性を有する退化したリボヌクレオチドパターンを識別することに基づいている。 同様の手法は、プロモーター配列における転写調節因子の同定に30年近く適用されてきた。 これらの方法は成熟しつつあり、非常に広く利用されており、転写制御に関するデータベース（例えば、TRANSFAC）の作成に大いに役立っている。 転写制御の文脈で制御配列解析アルゴリズムの設計と改良に向けられた研究の多くは、転写後制御要素の文脈で対応する解析問題に適応することができるが、RBP結合部位に関連したさらなる複雑さが存在する。 中でも最も明白なのは、RBPが二次構造の優先順位を持つことであり、既存の解析ツールでRNAの折りたたみに関する情報を組み込めるものはほとんどありません。 同様に、RNAの折りたたみによって、一次配列では遠くにあるが折りたたまれた分子では非常に近くにある配列要素に対して、制御要素がより簡単に相乗的に機能したり、協調的結合を示したりすることができる。 もう一つの困難は、解析の訓練となる翻訳制御エレメントの例がないことである。 よく研究されている一握りの例に基づいて、RBP結合部位は転写因子（TF）結合部位よりも平均的に短いという認識がしばしばありますが、この認識は、最も研究が進んでいるRBPのセットに偏りがあるためかもしれません。 制御部位を特定するための最も強力な方法の一つが、系統的フットプリンティングであり、局所的に高くなった進化的保存性を利用して機能的要素を明らかにするものである 。 この論理は、転写後調節因子についても同様に有効である。 残念ながら、TF結合部位は、翻訳に関与する5′UTR要素を同定するために計算機による配列分析を直接適用する際の大きな障害にもなっている。 転写制御に関与する要素は、転写開始点の上流と下流の両方に存在し、5′UTR が十分に短い場合、転写後制御要素は TF 結合部位と混在する可能性が高い。

最終的に、転写後制御要素を特定する最良の方法は、実験および計算技術を補完的に適用することから出現することになる。

謝辞

ペナルバ研究室の研究は、ヴォルカー財団、チルドレンズ脳腫瘍財団、5R21HG004664-02および1R01HG006015-01A1によって支援されている。

補足資料