自然乳化または高圧ホモジナイゼーションによって得られるレシチン系ナノエマルションの物理化学的特性

ARTIGO

Physicochemical properties of lecithin-based nanoemulsions obtained by spontaneous emulsification or high-pressure homogenization

Roselena S.Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F.H.H. (日本) Teixeira*, #

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

菜種レシチンまたはひまわりレシチンで固定した中鎖トリグリセリド油からなるナノエマルションは、自発乳化および高圧均質化を行うことで調製した． これらのナノエマルションは、卵レシチンで安定化された製剤と比較された。 高圧ホモジナイズで得られたナノエマルションは、自然乳化で得られたもの（190～310 nm）に比べ、大きな液滴サイズ（230～440 nm）を示した。 ゼータ電位は-25 mV以下の負電位であった。 ゼータ電位の反転はpH3.0から4.0の間で起こった。 この結果は、自然乳化と高圧ホモジナイゼーションにより、菜種やヒマワリのレシチンからなる脂質エマルジョンを調製できることを示している。

キーワード：ナノエマルジョン、レシチン、非経口投与、高圧ホモジナイゼーション、自然乳化

はじめに

非経口栄養法は基本的に、患者の状態、年齢、体重に応じて医師の処方のもと、多量栄養素（アミノ酸、炭水化物、脂質）と微量栄養素（ビタミン、電解質、マイクロエレメント）で構成されています1。 脂質多量栄養素は、エマルションとして投与され、エネルギー供与体、必須脂肪酸供給体、脂溶性ビタミン運搬体である。 これらの製剤に含まれる脂肪酸は、細胞膜の成分であり、ホルモンのシグナル伝達や輸送に特定の役割を果たすため、代謝上大きな重要性を持っています。 さらに、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、プロスタサイクリンの前駆体であり、炎症プロセス、腎機能、血小板凝集を調節します2。脳の発達期の早産児で必須脂肪酸が不足すると、学習障害や視覚機能障害が生じ、発達の後半に十分な脂肪酸含有食が与えられたとしても、不可逆的になる可能性があります2。

親水性脂質エマルションは、乳化剤の存在により、水相（分散媒）に油相が均質に分散した不均一系である。 大きな粒子を使用すると塞栓の危険があるため、通常は200～500 nmの小さな液滴サイズが製剤の特徴です。 3

脂質ナノエマルションは、3-in-1システムとして知られる全非経口栄養剤によく使用されており、これはすべての大栄養素と微量栄養素をエチルビニルアセテート(EVA) バッグに添加したものである。 しかし、これらの混合物には、電解質などの成分が含まれ、乳化液と相互作用して沈殿することがあり、物理的に不安定な状態になることがある。 カルシウムやリン酸塩の沈殿は、文献上広く報告されている。 さらに，2価のイオン（カルシウムやマグネシウムなど）はエマルションのゼータ電位に干渉し，脂質液滴の凝集・凝集を誘発し，その後，合体する可能性がある。 この現象は非常に深刻であり、直径5μm以上の液滴が血流に入ると脂肪塞栓症を引き起こす可能性がある。4,5

脂質エマルションの物理特性とそれに伴う安定性は、その製造方法および組成に強く関連している。3,6 製造方法は多様で、液滴サイズを小さくしたエマルションを製造するには複数のステップが必要となる場合がある。 例えば、高速ホモジナイザー（Ultraturrax®）により、まず粗いエマルションを生成することができる。 前処理を必要としない方法のうち、自然乳化は主に製剤研究に用いられ、高度な装置を使用する必要がないため、実験室規模で容易に行うことができる。 11

非経口エマルションの油相は長鎖トリグリセリド（LCT）からなり、表1に示すように中鎖トリグリセリド（MCT）と組み合わせることも可能である。 LCTは、ヒマワリ油、ヒマシ油、オリーブ油、あるいはより一般的には大豆油のような多種多様な油から構成されている。 これらの油は、いずれも炭素数12以上の脂肪酸鎖を有する。 MCTは、ヤシ油の脂肪酸をエステル化したものである。 注射用乳化剤の安定化には、生体適合性と生分解性からレシチンが選ばれている。 レシチンは、動物性または植物性原料から得られる極性および中性リン脂質の天然混合物です。12 植物性原料由来のレシチンのリン脂質組成は、抽出、作物、その他の加工条件により変動します。13 主にホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンなどの両性リン脂質を含みますが、陰性リン脂質も存在する場合があります。

市販されている非経口栄養剤の脂質エマルションは、卵黄レシチン、まれに大豆レシチン（ソリピッド®E&S）からなることがほとんどである。 脂肪の補給には多くの利点があるにもかかわらず、重症患者における代謝の制限および免疫反応により、長期の補給に関連した臨床上の有害作用が報告されている14,15。非経口的脂質エマルションに対する有害反応は、大豆および卵黄レシチンの存在と関連していると報告されている16-18。 薬物食物アレルギーの相互作用は、胃腸の不調からアナフィラキシーまで、さまざまな有害反応を引き起こす可能性があります19

こうした背景から、患者への非経口投与により安全な低アレルギー性の代替品を見つけるために、代替原料の探索が続けられています。 本研究では、卵や大豆由来の乳化剤に過敏な患者（特に早産児）に最も安全な選択肢を提供するため、非経口栄養を目的とした脂質エマルション、あるいは薬剤キャリアとしての新しい代替品を見つける目的で、異なるレシチンの探索を優先的に行っています。 我々は、菜種またはヒマワリレシチンによって安定化された非経口脂質ナノエマルジョンを開発し、卵レシチン含有ナノエマルジョンと比較することを目指した。 さらに、自然乳化による調製と、非経口脂質エマルションの工業的生産に一般的に用いられている高圧ホモジナイザーによる調製を比較しています。

材料と方法

化学物質と試薬

MCT、大豆油、卵黄（Lipoid E80®）、菜種（Lipoid R100®）、ひまわり（Lipoid H100®）レシチンはLipoid GmbH（ドイツ、ルートヴィヒスハーフェン）から提供されたもので、菜種とひまわりレシチンは同社の厚意で入手しました。 グリセロールとエタノールは、それぞれ Merck（ブラジル）と Sigma-Aldrich（St.Louis, MO, USA）より入手した。 超純水はMilli-Q® 装置（Millipore, Billerica, USA）から入手した。

ナノエマルションの調製

脂質エマルションは、自然乳化と高圧ホモジナイズの2つの方法で、3回に分けて調製した。 10,20 簡単に言えば、大豆油にMCT、レシチン、およびエタノールを混合し、自然乳化で得られた製剤を既知の手順に従って調製した。 グリセロールを水に溶解し、そこにエタノール相を適度な磁気攪拌下で30分間ゆっくりと添加した。 その後，回転式エバポレーターを用いて減圧下で蒸留し，溶媒を除去した。 まず、レシチンをグリセロールを含む水に分散させ、40 ℃で磁気撹拌しながら、均質な水相が得られるまで混合した。 油相は，大豆油とMCTから構成された。 油相と水相の両方を磁気攪拌下で混合し（15分、室温）、粗いエマルジョンを得た。 次に、IKA® Ultra-Turrax T8 mixer (IKA® Works Inc., NC, USA) を用いて9500rpmで2分間混合して粗プレエマルションを形成し、個別に750 bar (10 000 psi) で10サイクルの高圧均質化処理 (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Canada) を行って最終エマルションを生成させた。 すべての製剤のpH値は、0.01 mol L-1 NaOH溶液で8.0に調整された。 エマルジョンは4ºCで保存した． 製剤とその成分を表2に示す。

ナノエマルションの物理化学的特性評価

製剤のpH値は、室温で校正電位差計（Digimed、São Paulo、ブラジル）を使用して、調製直後の試料で直接決定された。 平均液滴径と多分散性指数は光子相関分光法（PCS）で測定し、ゼータ電位は電気泳動移動度で、Malvern Zetasizer Nano ZS（Malvern Instrument, UK）を用いて25℃で測定した。 これらの測定のために、ナノエマルジョンを1 mmol L-1 NaCl溶液で希釈し、pHを2.0から8.0単位まで変化させた。 粘度は、毛細管粘度計により、25ºC（粘度計定数、k = 0.0212）で、25±0.1ºCで評価した。 液体が毛細管内の上側のマークから下側のマークへ流れる時間を秒単位で記録した。 すべての製剤は三重で分析した。

形態学的分析

形態学的検査は透過電子顕微鏡（TEM）により行った。 ナノエマルジョン1滴をカーボンコート銅グリッド（200メッシュ）上に置き、2.0 %酢酸ウラニル溶液で陰刻染色し、24時間乾燥させてから検査した。

RESULTS AND DISCUSSION

本研究では、従来の非経口エマルション用安定剤である卵黄レシチン（E）に代わり、植物由来の2種類のレシチン（菜種（R）とひまわり（S））で安定化した非経口栄養または薬剤搬送用の脂質エマルションを開発した。 新しい製剤と従来の製剤を比較するため、他のすべての乳化成分を市販の脂質エマルジョン製剤と同様の濃度に保った。 また、この研究では、自然乳化と高圧ホモジナイズという2つの異なる製造方法についても比較しています。

表3は、得られたナノエマルションの物理化学的特性を示している。 自然乳化によって得られた製剤は、PCSによって決定された220から300 nmの平均液滴サイズを示す。 理論的には、これは高い乳化安定性の範囲である。7,23 液滴サイズが小さくなると、自己拡散速度が増大し、拡散混合によって非常に小さな液滴がクリーミングしないようにすることができる。 これらのデータから、大豆油、MCTおよび水の混合物を乳化するためには、1.2%の濃度で十分であると結論付けることができる。 しかしながら，小滴径で低分散のエマルションが得られたものの，調製後1週間以上物理的安定性が保たれず，相分離（合体）が目視で確認された． 25

乳化剤の種類と乳化方法に加え、ナノエマルションの質的・量的組成は、液滴サイズに直接影響を与える可能性がある7,23。 高圧ホモジナイズは、工業的規模ではあるが、このような製剤の製造に製薬業界で一般的に使用されている。 乳化に利用できるさまざまな方法の中で、液滴を効率的に破壊できることから、この方法が好まれている。 これは高エネルギー法であり、粗いエマルジョンを高圧下でホモジナイジングバルブを通して強制的に押し出し、それによって液滴を変形させてサイズを小さくするものである26。 自然乳化は低コストで簡単かつ信頼性の高い方法であり、実験研究では通常、より複雑で高価な高圧ホモジナイザーの代わりに使用されている。

表3に示すように、高圧ホモジナイゼーションは、菜種レシチン（296±18nm）またはヒマワリレシチン（417±25nm）からなるナノエマルションにおいて、以前の方法と比較して、また対照の卵レシチンエマルション（243±12nm）に対してより大きな液滴サイズを生成することが示された。 しかしながら、高圧ホモジナイズは、液滴の破壊効率が低いにもかかわらず、製剤の安定性をより向上させることを指摘しなければならない。 自然乳化で得られたエマルションとは異なり、これらは少なくとも30日間は視覚的に安定であった。 これらの結果は、乳化安定性の付与における調製法の重要性を裏付けるものである。

静脈内への応用を考えると、脂質エマルションの液滴のサイズ分布は平均液滴サイズよりもさらに重要であると思われる。 図1では、菜種レシチン（自然乳化により得られた、図1C）およびヒマワリレシチン（自然乳化または高圧ホモジナイズにより得られた、図1Eおよび1F）から成る製剤において、2つの集団が観察されている。 その結果、これらの製剤では、0.20より高い多分散性指数が得られています。

エマルションの安定性は、その界面膜（レシチン）の組成および特性と相関していると考えられる。なぜなら、これが製剤のゼータ電位および液滴間の反発を決定し、エマルション安定化のメカニズムの1つであるからだ27 レシチンはリン脂質の不均質な混合物である。 レシチン混合物の主なリン脂質はホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンで、生理的 pH (7.4) では非帯電性である。 ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどの少量の酸性脂質も存在することがある。 これらの脂質はpH7.0でイオン化し、エマルション液滴に負の表面電荷をもたらし、液滴の安定性に寄与している。 この電荷を阻害する物質を添加すると、系の安定性が変化する可能性が高い29。 非経口用レシチンが高度に精製されていても、本研究で使用した3つのレシチン原料の組成を記載した表4に示すように、他のリン脂質が少量含まれている。

表3に示すように、菜種またはヒマワリのレシチンからなり自然乳化で得られたナノエマルションでは、より小さなゼータ電位（モジュール値）が観察される。 しかし、高圧ホモジナイザーで製造したナノエマルションのゼータ電位には差が見られない。 これらの結果から、ゼータ電位に影響を与える主な要因は調製方法であることが示唆された。 我々のグループでは、いずれの方法も最適化しているが、通常、製剤の組成を考慮して実験条件を調整する必要がある。 30,31

ナノエマルションのゼータ電位は、乳化剤のイオン化にも依存します。 32 異なるレシチンからなり、異なる乳化方法で製造されたナノエマルションのゼータ電位と平均液滴径を、pH 2.0 から 8.0 の範囲で評価した。 その結果を図2に示します。

卵レシチンで安定化したトリグリセリドエマルションであるIntralipid®で以前に観察されたように、すべての処方の表面電荷はpH 3.0 から 4.0 の間でゼロまで減少します25。 ゼータ電位は pH に依存する。リン脂質表面の電位決定イオンである H+ は等電点 pH が 3.1 である33 。pH が低下すると、ゼータ電位の低下（負の値の減少）および凝集速度の上昇をもたらす34 。 図 3 から、ナノエマルションの pH は、油滴間の最大反発が観察されるその pH 値でプラトーが達成されるため、好ましくは 7.0 より高くする必要があると結論付けることができます。

最後に、高圧ホモジナイズによって調製したナノエマルションの油滴の形態をTEMによって調べた。 図3から，均質で球状の粒子が確認でき，エマルション液滴の平均液滴径がナノメートル領域であることがわかった。 これらの結果は、以前の液滴サイズ分析を裏付けるものである。

ナノエマルションは、ニュートン挙動を示す低粘性システムである。 高粘度のエマルションを静脈内投与すると患者に大きな苦痛を与えるため、エマルション粘度の評価は非常に重要である。23,32 異なるレシチンからなるナノエマルションは類似の粘度を示した。 35 一方、異なる調製方法で得られた製剤では、粘度にいくつかの違いが観察された。自然乳化ではわずかに粘度の高いエマルションが得られた。 他の乳化剤を使用する場合は、その濃度や乳化条件の最適化が必要となる場合がある。 大豆レシチン（Solipid®）を用いた市販の注射用ナノエマルションは、例えば乳化剤の濃度を1.5 %にする必要がある。 乳化を安定化させ、多分散性を抑え、液滴を小さくするために共乳化剤が使用されることもある。 非経口栄養剤は投与量が多く、特に早産児の場合、安全性に問題があるため、共乳化剤はあまり使用されません。 オレイン酸ナトリウムは、陰イオン界面活性剤および可溶化剤として作用し、注射用脂質エマルションの処方を安定化するために一般的に使用されている36。 製剤の長期安定性を向上させるために、乳化条件を最適化するためのさらなる研究が必要です。

The authors will like to thank the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) for financial support and Lipoid GmbH for materials provided.

1. Waitzberg, D. L.; Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica, 1st ed., Atheneu: São Paulo, 2009.

2. Adolph, M.; Clin. Nutr. 2001,20,11.

3. Bruxel, F.; Laux, M.; Wild, L. B.; Fraga, M.; Koester, L. S.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2012,35,1827.

4. Antunes, M.; Guedes, J.; Arq. Bras. Med. 1994,68,303.

5. Trissel, L. A.; Gilbert, D. L.; Martinez, J. F.; Baker, M. B.; Walter, W. V.; Mirtallo, J. M.; JPEN, J.パレンテル. Enteral Nutr.1999,23,67。

6. Almeida, M. E.; Teixeira, H. F.; Koester, L. S.; Lat. Am. J. Pharm. 2008,27,780-88.

7. ベニタ, S.; レヴィ, M. Y.; J. Pharm. Sci. 1993,82,1069.

8. Robin, O.; Blanchot, V.; Vuillemard, J. C.; Paquin, P.; Lait 1992,72,511の項参照。

9. Mbela, T. K. M. N.; Ludwig, A.; Landau, I.; Deharo, E.; Haemers, A.；Int.J.S.S.A.（日本学術振興会特別研究員）,（日本学術振興会特別研究員）。 J. Pharm. 1994,110,89.

10. Bouchemal, K.; Briançon, S.; Perrier, E.; Fessi, H.；Int.J.Pharm.；1994,110,89。 J. Pharm. 2004,280,241.

11. Klang, S.; Benita, S. In Submicron emulsions in drug targeting and delivery; Benita, S., ed; Harwood Academic Publishers: Amsterdam, 1998, chap. 5.

12. Szuhaj, B. F.; Sipos, E. F. In Food Emulsifiers: このような場合、”Chemistry, Technology, Functional Properties and Application; Charalambous, G., Doxastakis, G., eds.; Elsevier Science Publishers B. V.: Amsterdam, 1989, chap. “を参照されたい。 10.

13. Schneider, M. In Lecithins: Sources, Manufacture, & Uses, American Oil Chemists’ Society: イリノイ州、1989年

14. Szuhaj, B. F. In Bailey’s Industrial Oil and Fat Products; Shahidi, F., ed.; John Wiley and Sons: New Jersey, 2005, vol.3, chap. 13.

15. Adan, D.; La Gamma, E. F.; Browne, L. E.; Crit. Care Clin. 1995,11,751.

16. Himaya, D. T.; Griggs, B.; Mittman, R. J.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1981,13,318.

17. ブッフマン、A.L.；アメント、M.E.；JPEN、J.パレンテル。 Enteral Nutr.1991,15,345。

18. Kamath, K. R.; Berry A.; Cummins, G.; New Engl. J. Med. 1981,304,360.

19. Wiesner, A. M.; Romanelli, F.; Stratman, R. C.; Smith, K. M.; Orthopedics 2008,31,149.

20. Yu, W.; Tabosa Do Egito, E. S.; Barrat, G.; Fessi, J. P.; Devissaguet, J. P.; Puisieux, F.; Int. J. Pharm. 1993,89,139.

21. フロイド，A.G.；Pharm. Sci. Technol. 1999,2,134.

22. ドリスコル，D.F.；Pharm. Res. 2006,23,1959に記載されています。

23. コンスタンチニデス，P.P.；トゥスティアン，A.；ケスラー，D.R.；Adv.R.． Drug Deliver. Rev. 2004,56,1243.

24. Martini, E.; Carvalho, E.; Leão, F.; de Oliveira, M. C.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2007,30,930.

25. ワシントン、C.；Adv. Drug Deliver. Rev. 1996,20(2-3),131を参照。

26. Walstra, P.; Smulders, P. E. A. In Modern Aspects of Emulsion Science; Binks, B. P., ed.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 1998, chap. 12.

27. を参照されたい。 Philadelphia, 2001.

28. ローレンス、M.J.; Curr. Opin. Colloid Interface Sci.1996,1,826。

29. ワシントンC.;Int. J. Pharm. 1990a,66,1.

30. Dias, D. O.; Colombo, M.; Kelmann, R. G.; Souza, T. P. D.; Bassani, V. L.; Teixeira, H. F.; Anal. Chim. Acta 2012,721,79.

31. Fraga, M.; Laux, M.; Zandoná, B.; Santos, G. R.; Giuberti, C. S.; de Oliveira, M. C.; J. Drug Delivery Sci. Technol. 2008,18,398.

32. ジュマア、M.；ミュラー、B.M.；Int. J. Pharm. 1998,163,81; Roland, I.; Piel, G.; Delattre, L.; Evrard, B.；Int.J.Pharm.誌(1998,163,81)。 J. Pharm. 2003,263,85.

33. デイビス，S.S.；ギャロウェイ，M.；J.Pharm.． Pharmacol. 1981,33,88.

34. ワシントン，C.；Int. J. Pharm. 1990a,64,67.

35. Silvander, M.; Hellstrom, A.; Warnheim, T.; Claesson, P.; Int. J. Pharm. 2003,252,123.

36. Formariz, T. P.; Sarmento, V. H. V.; Silva-júnior, A. A.; Scarpra, M. V.; Santilli, C. V.; Oliveira, A. G.; Colloids Surf., B 2006,51,54。

2014/02/03受付、2014/04/17受理、2014/07/15ウェブ公開

。