細菌胞子のナノバイオテクノロジーへの応用

胞子膜はタンパク質からなり、原基サブユニットが整然と並び、自己組織化を示して保護特性を有している … 続きを読む 代謝のない休眠状態の生命体である胞子は、乾燥した状態で無限に生存することができ、実際、何百万年もそのまま生存していることが記録されている。 胞子は、90℃の高温や有害な化学物質への曝露にも耐えることができる。 ほとんどの芽胞形成細菌（すべてではない）は、Bacillus属とClostridium属の2つの主要な属に属している。 クロストリジウム属の胞子形成細菌はバチルス属と異なり、嫌気条件下でのみ分化するため、バチルス属が最も研究しやすい属である。

バチルス属は、細菌細胞内に単一の胞子または内胞子（真菌の外胞子とは異なる）を作り、数百の発生遺伝子の協調作用を要する分化のプロセスによって、この内胞子を形成する。 通常、成熟した胞子は0.8-1.2μmの長さで、球形または楕円形の形をしている（図1A参照）。 単一細菌の染色体は、コアと呼ばれる胞子の中心部に凝縮されている。 胞子核の周囲には、脂質膜と修飾ペプチドグリカンの層があるが、最も重要な構造は胞子膜である。 この積層されたタンパク質性の殻は、胞子に有機溶媒やリゾチームに対する抵抗力を与えている。 枯草菌では、25種類ものコートタンパク質が内被と外被の2つの層に分かれて存在している（図1B）が、他の種では、コートはそれほど複雑ではなく、場合によっては数種類のタンパク質で構成されているという証拠がある . 胞子膜の構造と組み立ては、ファージT4の組み立てに関する古典的な研究と同様に、複雑な形態形成の組み立て過程を理解するためのモデルシステムとして、現在、台頭してきている。 枯草菌の外被は、5つの主要なポリペプチド、CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) と CotF (8 kDa) から構成されており、電子密度の高い層である。 CotAはマルチ銅酸化酵素であり、いくつかのコート欠損変異体では胞子細胞内に多量体として蓄積する（顕微鏡で観察）ことができる 。 おそらく、CotAのオリゴマー化と自己組織化は、胞子膜表面への沈着に先行して起こるのだろう。 CotGとCotBタンパク質も共有結合で相互作用することが示されており、さらにCotGとCotCは、リジンとチロシンに富む12-13アミノ酸の多重反復（>13）を含む極めて珍しいアミノ酸配列を持っている。 さらに、胞子膜タンパク質の多くは、SDS-PAGEで調べると、多量体や異常な分子量など、異常なプロフィールを持つ。 最近、胞子膜は柔軟で伸縮自在であることが明らかになった。この特徴は、胞子が脱水したときの胞子形成と、胞子が再水和したときの発芽に重要である。 自己組織化構造のこの側面は特に興味深く、薬物送達、ナノ加工、表面コーティングなど、多くの将来のアプリケーションを提供するかもしれません。 パネルAは枯草菌の胞子で、そのうちの1つは棒状の「母細胞」内にまだ保持されている。 枯草菌の胞子は長さ約1.2μmで楕円形をしている。 放出された胞子は、胞子膜と呼ばれる透明な保護膜を持ち、25種類ものプロトマー成分が離散的な層に組み合わされて構成されている。 パネルBは、可溶化した胞子膜タンパク質の典型的なSDS-PAGE (12.5%) 分画で、主な種を明らかにしている。

Engineering the Bacterial Spore Coat

Bacillus subtilis sporeが、異種の抗原を胞子表面に表示するよう技術する戦略は最近報告されているが、図2に示すように、これは、この胞子表面上の抗原が、胞子膜に結合していることを示す。 胞子ベースのディスプレイシステムは、細菌細胞の使用に基づくシステムに関していくつかの利点を提供する。これらには、乾燥形態での保存を可能にする細菌胞子の堅牢性、生産の容易さ、安全性、および遺伝子操作のための広範なツールに支えられた技術的プラットフォームが含まれる

胞子のコートタンパク質を用いた表面表示。 枯草菌の胞子は、ペプチドグリカン様の皮質（赤色）に囲まれた内部コア（黄色）と、内側（緑色）と外側（黒色）に分かれたタンパク質性コートから構成されている。 4777>

成長する細胞から休眠胞子への分化を遺伝子発現がどのように制御するかについては豊富な情報があるが、被膜へのタンパク質取り込み機構、被膜の最外部を形成する構造要素の性質、固定モチーフの有無についてはほとんど分かっていない。 異種タンパク質を胞子表面に露出させる最初の試みは、CotBとCotCという2つの被膜成分に焦点を当てたものであった。 CotBの場合、この胞子コートタンパク質は表面に位置することが知られているが、CotCの場合、他のコートタンパク質と比較して、この種は相対的に高い存在量を持っている 。 これらの外被成分の両方が、見かけ上正常な胞子の形成とその発芽に必要でないという観察は、CotBとCotCをキャリアタンパク質として選択する上で、さらなる好ましい特徴であった。

当初、胞子表面に表示するモデルタンパク質として2つの抗原が選ばれた：i）破傷風毒素（TTFC）の無毒な459アミノ酸C末端フラグメント、よく特徴づけられ、高い免疫原性を持つ51．8kDaのペプチドで、Clostridium tetaniのtetC遺伝子によってコードされている。また、eltB遺伝子によってコードされた12kDaのペプチドで、Escherichia coliの腸毒性株の熱-毒素（LTB）の103アミノ酸Bサブユニットである。

キャリアータンパク質としてのCotB

他の被膜成分と同様に、CotBは遺伝的証拠に基づいて外被層に関連付けられたが、最近になって無傷の胞子で行われた免疫蛍光分析により、CotBにはCotB特異抗体が作用するので、おそらく胞子表面に露出されていることが判明した …

CotB構造遺伝子cotBは、σKとDNA結合タンパク質GerEの二重転写制御下にある。 その結果、cotBは胞子形成細胞の母細胞コンパートメントでのみ転写される。 母細胞の細胞質で合成されたCotBは、CotE、CotG、CotHに何らかの形で依存しながら、形成中の胞子の周りに集合される。 そのため、CotBとそれに融合した異種タンパク質は、他の細菌のディスプレイシステムに典型的な細胞壁の移動ステップを経ない。

CotBは、セリン、リジン、グルタミン残基に富んだ3つの27アミノ酸繰り返しによって形成された強い親水性C末端の半分を持っている。 セリン残基はCotB C-末端半分の50%以上を占めている。 CotB反復配列中のリジン残基は、結合組織タンパク質であるコラーゲンやエラスチンと同様に、分子内または分子間の架橋部位であることが示唆されている。 CotBタンパク質の分子量は46 kDaと推定されているが、SDS-PAGEでは59 kDaのポリペプチドとして泳動される。 最近、CotBは最初に46 kDaの種として合成され、CotBヌクレオチド配列から予測されるN末端とC末端の両方を保持する59 kDaのホモダイマーに変換されることを示すことによって、実測と推論の分子量の不一致が説明された。 CotB-TTFC または CotB-LTB を表面に発現する枯草菌胞子を得るための戦略は、（i）翻訳融合体の構築に cotB 遺伝子とそのプロモーターを使用し、（ii）非必須遺伝子 amyE のコード配列に cotB-tetC および cotB-eltB 遺伝子融合体を染色体上で統合することに基づく（図 3A） 。 この融合タンパク質を cotB の転写および翻訳シグナル下に置くことで、胞子形成時の正しい発現 タイミングを確保し、染色体上に組み込むことで構築物の遺伝的安定性を保証した。 CotBコートのアセンブリおよびアンカーモチーフの要件に関する情報が不足しているため、最初の試みは、パッセンジャータンパク質をC-末端、N-末端またはCotBの中間に配置することによって行われた（図3B）。 (A)遺伝子融合体の染色体上への組み込みの模式図。 赤い棒は遺伝子融合体、灰色と緑の棒はそれぞれ統合部位として用いた枯草菌の非本質的なamyE遺伝子と選択マーカーとして用いたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子を表している。 (B）全長CotB（380アミノ酸）、CotBΔ105（275アミノ酸）またはCotC（66アミノ酸）のいずれかをキャリアタンパク質として用いた融合タンパク質の模式図（すべて青色で表示）。 全長CotBの3つの27アミノ酸の繰り返し部分とCotBΔ105に残っている部分は黒色で表示されている。 紫色の棒は融合した異種タンパク質部分（TTFCまたはLTB）を表す。

CotBのC末端にTTFCとLTBを融合した場合、キメラタンパクは胞子表面に正しく集合できなかった（Isticato and Ricca, unpublished）。 このような初期の失敗は、DNAレベル（反復DNA配列）またはタンパク質レベルでの構築物の潜在的な不安定性に起因していた。 このような問題を回避するために、TTFCとLTBを、3つの27アミノ酸反復配列を削除したCotBフォーム、CotBΔ105-TTFCのC末端に融合させた（Fig. 3A）。 CotBΔ105-TTFCキメラタンパク質は、全長版とは対照的に、胞子表面に正しく集合して露出していた。 定量的ドットブロットにより、各組換え胞子は0.00022 pgのCotBΔ105-TTFC融合タンパク質を露出しており、各組換え胞子の表面には1.5 × 103個のキメラ分子が存在していると結論することができた。 このキメラを発現する株は胞子形成と発芽効率の低下を示し、その胞子はリゾチームに抵抗性を示さなかった。 これらの観察結果と、放出されたコートタンパク質の SDS-PAGE 分析から、CotBΔ105-LTB の存在は、胞子コート層を強く変化させることが示唆された。 インシリコ解析により、キメラ産物（融合領域）と枯草菌が植物成長中に生産する細胞壁関連エンドペプチダーゼであるLytFとの間にいくらかの相同性が示された。したがって、キメラ産物は、いくつかのコート成分を分解することによって適切なコート形成を妨げる可能性がある（Mauriello and Ricca, data not shown）。

上記のC末端融合に加えて、モデル乗客タンパク質TTFCは、CotBのN末端および中間部でも融合された（図3B）。 どちらの場合も、C末端融合で経験した問題（上記参照）を避けるため、CotBΔ105フォームのCotBが使用された。 N末端融合とサンドイッチ融合は、質的にも量的にも、コート構造に適切に組み入れられたキメラ生成物をもたらした。 少なくともCotBの場合、パッセンジャー蛋白質が露出しているところでは、胞子表面での表示に影響を与えないと結論づけることができた。

キャリア蛋白としてのCotC

CotCは枯草菌の胞衣の12kDaのアルカリ可溶性成分で、以前リバースジェネティクスによって同定し、遺伝的証拠に基づいて外被層に関連した． CotCは当初、被膜中に比較的多く存在することから、キャリアー候補として考えられていた（図1B）。 CotCは、CotGとCotDと合わせて、可溶化したコートタンパク質全体の約50%を占めている。 このように比較的多い量であれば、コート上に相当数のCotCベースのキメラを組み立てることができ、効率的な異種発現を確保することができる。 cotC遺伝子の発現は、母細胞特異的なσ-factor σKと、転写調節因子GerEおよびSpoIIIDの制御下にある。 CotBと同様、CotCも母細胞で転写され、コート上での組み立てには膜の移動を必要としない。 cotC遺伝子の主要産物は、チロシン残基（30.3%）とリジン残基（28.8%）に極めて富んだ66アミノ酸のポリペプチドである . しかし、最近、CotCは少なくとも4つの異なるタンパク質形態に組み立てられ、その大きさは12から30kDaであることが明らかにされた 。 これらのうち、分子量12kDaと21kDaの2つは、それぞれCotCの単量体およびホモ二量体であると考えられ、胞子形成開始8時間後の合成直後に形成胞子上に集合している。 他の2つの形態、12.5および30kDaは、おそらく他の2つの形態の翻訳後修飾の産物であり、胞子成熟中にコート表面で直接起こる

CotCの場合、これまでC末端融合体のみが構築されてきた(図3B)。 CotC-TTFCおよびCotC-LTB遺伝子融合はいずれも、cotCプロモーター領域の転写および翻訳制御下で、tetCまたはeltBを最後のcotCコドンと共にフレーム内にクローニングすることによって得られた。 この遺伝子融合体は、二重クロスオーバー組換えにより、枯草菌の染色体上のamyE遺伝子座に組み込まれた(図3A)。 これら2つのキメラタンパク質はいずれも、胞子形成や発芽の効率、抵抗性などの点で野生型胞子と同じように見えるため、胞子構造および/または機能に大きな影響を与えることなく、組換え胞子の被膜上に集合させた。 ウェスタンブロット、細胞蛍光法、およびCotC-TTFCについては免疫蛍光顕微鏡法（図4）により、両方のCotCを用いたキメラが組換え胞子の表面に発現していることが示された。 枯草菌胞子上に露出した組換えタンパク質の定量を行ったところ、約0. 4777>

免疫蛍光顕微鏡によるCotC-LTBおよびCotC-TTFCの存在の検出。 枯草菌の胞子形成は再懸濁法で誘導し、胞子形成開始6時間後にサンプルを採取し、前述のように免疫蛍光顕微鏡で分析した。 サンプルは、マウス抗LTB抗体と抗マウスIgG-TRITCコンジュゲート（赤色フルオレセイン、パネルA & B）、またはウサギ抗TTFC抗体と抗ラビットIgG-FITCコンジュゲート（緑色フルオレセイン、パネル & D）で標識された。 パネルA & C、野生型胞子；パネルB、CotC-LTBを発現する同系胞子；パネルD、CotC-TTFCを発現する同系胞子。

CotCはCotBよりコート内で豊富に見えるものの、CotCベースおよびCotBΔ105ベースのシステムによって同量の異種タンパク質が露出されている。 CotCはCotBよりも被膜中に多く存在するように見えるので、この結果はやや予想外であった。 CotCのC末端は、他のCotC分子だけでなく、他の被膜成分との相互作用にも必須であるという最近の発見から来る可能性があり（Isticato and Ricca、原稿準備中）、したがって、キャリアとしてのCotCの使用は、依然として最適化する必要があることを示す。 胞子は、その抵抗性と安定性の特性を低下させることなく、単に室温で長期間保存することができる。 これは、さまざまなバイオテクノロジーの応用に極めて有用な特性であると考えられる。 例えば、パッセンジャータンパク質が抗原である場合、組換え胞子は、流通や保管が不十分で熱安定性が最も懸念される発展途上国で使用するための理想的な熱安定性経口ワクチンになり得る。

しかしながら、胞子の安定性はよく知られている一方で、胞子表面上に露出する異種タンパク質の安定性はごく最近検討されただけである。 CotBΔ105-TTFC（上記参照）を発現する胞子と親胞子を-80℃、-20℃、+4℃、室温で保存し、12週間までの異なる保存時間でアッセイを行った。 いずれの場合も、組換え胞子の表面に存在する異種タンパク質の量は、調製したばかりの胞子と12週間まで保存した胞子とで同一に見えた（図5）。 これらの結果は、異種タンパク質を組換え胞子表面に安定的に露出させることができることを示しており、胞子ベースのシステムは、他のシステムのいくつかの欠点を克服し、多様なバイオテクノロジーの分野でアプリケーションを見つけることができる非常に有望なディスプレイアプローチであることが確認された。

野生型胞子およびCotBΔ105 -TTFCキメラを曝露した胞子から抽出したタンパク質のドットブロット分析。 CotBΔ105-TTFCキメラを発現する精製したばかりの胞子（t0）、または4、8、12週間（t4、t8、t12）室温で保存した後、抽出した胞子コートタンパク質のドットブロットによる検査を行った。 精製TTFCの濃度（ナノグラム）およびコートタンパク質の濃度（マイクログラム）を示す。 タンパク質はモノクローナル抗TTFC抗体（Boeringher）と反応させ、次にホスファターゼ標識二次抗体と反応させた。 精製したばかりの芽胞と室温で12週間保存した芽胞で同様の強さのシグナルが得られた。

破傷風をモデル疾患とした経口ワクチンの原理証明

CotBΔ105-TTFC を発現した芽胞を用いて、マウスへの経口免疫に成功した。 血清IgGと糞便sIgAはTTFCに対して明らかなセロコンバージョンを示した。 投与スケジュールは、5週間かけて3セット（1.67×1010）を投与し、経口免疫に最適化されたレジームに基づいていた。 33日後のTTFC特異的IgGの力価（>103）は保護レベルであり，10LD50の破傷風毒素に暴露されたマウスは完全に保護された． また、20LD50を投与した8匹のマウスのうち7匹が生存しており、これが防御の閾値であることが示唆された。 同様の研究がCotB-TTFC芽胞を用いた鼻腔免疫法でも行われたが、より低用量で3回の免疫であった。 ここでは、TTFC特異的IgG反応は低かったが、それでもセロコンバージョンが見られた。 これらの研究は、異種抗原を発現する工学的芽胞を保護免疫に使用できることを示している。 さらに、粘膜反応はクロストリジウム・テタニ（全身性病原体）に対する防御には重要ではないが、粘膜病原体に対しては明らかに重要である。 投与方法の最適化（より少ない投与量、より少ない芽胞数）にはさらなる研究が必要であるが、これらの画期的な研究により、特定の粘膜病原体に対する開発の道が開かれた。 これらの研究は心強いものであり、体液性反応を示しているが、細胞性反応を示す明確な証拠はまだない。 しかし、芽胞はGALTに播種され、パイエル板（PP）や腸間膜リンパ節で発見されることが示されている。 芽胞のサイズが小さい（1μm）ため、M細胞に取り込まれ、PPに運ばれ、そこで抗原提示細胞と相互作用することができるのであろう。 初期の研究では、芽胞は腸管マクロファージ内で発芽して短期間とどまり、IFN-γなどのTh 1サイトカインをin vivoで誘発することが示されている

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