クロマチンアクセシビリティとアーキテクチャ

図3：クロマチンのコンフォメーション技術。 3C、4C、5C、ChIA-PET、Hi-Cの様々なステップ。

Chromatin conformation capture (3C)

3Cではホルムアルデヒド架橋を使って三次元クロマチン構造を固定し、続いて制限酵素による消化が行われる。 その後、切り出したDNA断片をqPCRとシークエンスで解析し、離れたDNA領域がどこでつながっているのかを特定する。 このように生体内の3次元クロマチン構造と相互作用を解析する手法は、2002年に初めて開発された（Dekker et al,

Circularized chromosome conformation capture (4C)

4C は、関心のある遺伝子座と相互作用するこれまで知られていなかったDNA領域を特定できるため、特定の領域内で新しい相互作用を発見するために理想的です (Dekker et al., 2002)。 2006）。

4Cの役立つヒント：

• 正しい制限酵素を選択する。 より頻繁なカッター(すなわち4bpの認識部位)は、目的の領域と同じ染色体上の近くの配列との局所的な相互作用に適している (van der Werken et al., 2012)
• 架橋を最適化する。 ホルムアルデヒド濃度が低いと、望ましくない関心領域の自己連結が促進されるが、制限酵素による切断を妨げるDNA「ヘアボール」を防ぐこともできる。 高ホルムアルデヒド濃度では、自己結紮は減少するが、ヘアボールが増加する。 これらのバランスを考慮し、特定の実験状況に応じて最適なホルムアルデヒド濃度を選択する必要がある。

Carbon copy chromosome conformation capture (5C)

5C は、標的遺伝子座と結合するDNA領域から任意のライゲーション生成物のライブラリを生成し、それをNGSで分析します。 5Cは、特定の染色体の詳細な相互作用行列を図式化する場合など、ある領域のすべての相互作用について非常に詳細な情報を必要とする場合に理想的である。 しかし、5Cは各5Cプライマーを個別に設計する必要があるため、真の意味でのゲノムワイドではなく、特定の領域に最適である(Dotsie and Dekker, 2007)

5C helpful hints:

• Select the right restriction enzyme. 特定の実験条件下で効率的に機能する酵素を選択することが重要である。 例えば、BamHIは3C条件下では効率が悪いため、ほとんどの実験では推奨されない(Dotsie et al., 2007)。
• プライマー設計を最適化する。 5Cでは、ライゲーションサイトの上流に結合するフォワード5Cプライマーと、すぐ下流に結合するリバースプライマーの2つのプライマーを使用する。 プライマーが制限断片と正確にアニーリングするように、アニーリング温度が65℃程度になるようにプライマーの長さを調整する。 5Cプライマーはライゲーションのために5’末端にリン酸を持つように合成する。
• コントロールテンプレートを使用する。 これにより、プライマーの効率の違いをコントロールすることができる。 研究対象の全ゲノム領域から構築したコントロールライブラリーを推奨する。

Chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing (ChIA-PET)

ChIA-PET は、ChIP と 3C を組み合わせて、特定のタンパク質を通して、離れたDNA領域の相互作用を分析します。 例えば、転写因子結合部位は、ChIA-PETで研究するのが最適です。この手法では、相互作用を確認するために、in vivoで転写因子と結合しているDNAを必要とするからです（Fullwood et al.、2009年）。 ほとんどの3C技術と同様に、バックグラウンドノイズは技術的な課題です。 特にChIA-PETでは、ノイズのために目的の遺伝子座との長距離相互作用の検出が困難になることがあります。

ChIP-loop

ChIP-loopはChIPと3Cを組み合わせたもので、目的のDNA領域に結合すると思われるタンパク質に照準を合わせた抗体を使用するものである。 ChIP-loopは、既知の2つのDNA領域が、目的のタンパク質を介して相互作用しているかどうかを調べるのに適している。 また、ChIP-loopは相互作用の疑いのある領域の確認には適していますが、新規の相互作用の発見には適していません(Horike et al., 2005)。

ChIP-loop helpful hints:

• Non-native Loopを避けてください。 ChIP-loopの最大の問題は、ライゲーション前のDNA濃縮時に形成されるnon-native loopsの形成である。 これを回避する簡単な方法は、ライゲーションステップの後に沈殿を行うプロトコルを選択することである(Simons et al., 2007)。
• ChIP-loop相互作用を検証する。 ChIP-loopにおけるもう一つの課題は、ライゲーション産物を正確に定量することである。 3C技術、特にChIP-loopは、ランダムな相互作用を捉えることが多い。 これに対処するために、ChIP実験を並行して行い、それを使ってChIP-loopの相互作用を検証することを検討する。 ChIP-loopで同定されたDNA-タンパク質-DNA相互作用が本当に実在するなら、DNA-タンパク質相互作用の両方がChIPデータにも現れるはずです(Simons et al., 2007)

Hi-C

Hi-C は全ゲノムからリガンド生成物を増幅して、ハイスループット配列決定により頻度評価を行うものです。 例えば、腫瘍細胞における染色体構造のゲノムワイドな変化のマッピング(Lieberman-Aiden et al., 2009)など、ゲノム全体を広くカバーする必要があり、分解能はあまり気にしない場合にHi-Cは最適な選択となる。 Hi-Cライブラリーの増幅は、PCRアーティファクトを回避しながら、解析に十分な産物を生成する必要がある。 そのためには、PCRのサイクル数を最適化する必要がある（9-15サイクルの範囲）。 十分な産物(50 ngのDNA)が得られない場合は、サイクル数を増やすのではなく、複数のPCR反応をプールする必要があり、通常は5回の反応で十分である (Belton et al., 2012)

Capture-C

3CとOCT（オリゴヌクレチオド捕捉技術）とハイスループット配列決定の組み合わせで、一度に数百の遺伝子座を研究することが可能です。 Capture-Cは、高解像度とゲノム規模での解析の両方が必要な場合に理想的です。 例えば、ゲノム内のあらゆる疾患関連SNPの局所的なクロマチン構造への機能的影響を解析する場合（Hughes et al.、2014）

Capture-C helpful hints:

• 慎重にプローブ位置を選択します。 プローブは制限酵素サイトの近くに、可能であれば重なっても配置するのがベストです(Hughes et al., 2014)。
• ライブラリーは複雑に保つ。 ライブラリーの複雑さを維持することは最優先事項である。 複雑なライブラリは、出力される相互作用の質が高いことを意味します。 このため、Hi-Cビオチンキャプチャーのようにライブラリーの複雑性を低下させるものは避けるべきである（Hughes et al.，2014）。
• 重複領域での誤った相互作用に注意する。 マッピングプロセスでは、実際には人工物であるこれらの領域（偽遺伝子など）間の強い相互作用を刺激することができる（Hughes et al., 2014）

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y and Dekker J (2012). Hi-C: ゲノムのコンフォメーションを捉えるための包括的な技術。 メソッド, 58, 268-76.

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