アポ酵素

5.11.3 タンパク質の役割-酵素、補酵素、基質の相互作用

いずれの場合も吸収スペクトルに大きな変化はなく補酵素はアポ酵素に結合していることがわかった。 このことは、酵素がコリン環を基底状態の溶液コンフォメーションから歪ませないことを示唆している。 しかし、補酵素-タンパク質複合体の紫外可視吸収スペクトルから、α-軸配位子の正体に関する情報は得られない。 コバラミン依存性酵素であるメチオニン合成酵素、4,7メチルマロニル-CoAムターゼ、8,45,46グルタミン酸ムターゼの少なくとも3種では、α-軸の5,6ジメチルベンズイミダゾール配位子がそれぞれのタンパク質由来のヒスチジン側鎖に置換されていることがわかっている47。 一方、ジオールデヒドラーゼ48やリボヌクレオチド還元酵素に結合するAdoCblでは、コバラミン由来の5,6-ベンゾイミダゾール配位子が依然としてα-軸配位子を占めている（5.08章参照）。

ヒスチジン側鎖による配位を収容するために、5,6-ジメチルベンズイミダゾール塩基、リボフラノシルホスホジエステルおよびプロピオンアミド側鎖の「ヌクレオチドループ」はコリン環から離れ、タンパク質内の結合ポケットに挿入されなければならない。 コバルト依存性酵素では、α-軸リガンドをヒスチジン側鎖に置き換えたコンセンサス配列DxHxxGが同定されている7, 49, 50。コバルト原子に配位するヒスチジンは、水素結合を介してアスパラギン酸残基と確実に相互作用していると考えられる。 活性部位の他の残基もまた、金属中心での反応性を制御するための拡張水素結合ネットワークに参加しているかもしれない7。

アデノシルコバラミン依存性酵素は、観察された触媒作用の速度を達成するために、CoC結合のホモリシス速度を少なくとも1012倍増加させなければならない。14 アデノシルコバラミンがラビライズするには、ホモリシス分裂ができるようにCoC結合を弱化させる必要がある。 コバラミン依存性酵素において証明された概念ではないが、CoC結合を歪める（弱める）のに十分なエネルギーは、コバロチン補酵素との複数の水素結合相互作用から得られる過剰な結合エネルギーを利用することで容易に得られる可能性があり、その中にはコリン環を飾るアミド側鎖が含まれている51。 特定のアミド側鎖の除去または化学的誘導体化により、トランスコバラミンとの結合が3-40倍変化し52、c-アミド側鎖の完全除去により、大環状骨格にさらなる二重結合を導入し、コリン環を平らにし、それに伴い吸収最大値が赤方偏移している53。

目的の反応を促進することに加えて、アデノシルコバラミン依存性酵素は、ラジカル反応にしばしば伴う不要な副反応を防ぐことによって、第2の重要な機能を果たす54。この負の触媒の機能54には、自由エネルギー表面に沿って反応が進行する深い峡谷として想定される、高度な拘束を受けた自由エネルギー表面が必要である。 この峡谷は、副反応を防ぎ、反応性の高いラジカル中間体を拘束するために、急峻な壁を備えていなければならない。 反応の最後には、5′-デオキシアデノシルラジカルとコブ（II）アラミンとの再結合によってラジカル中間体が消滅し、アデノシルコブ（III）アラミン補酵素の基底状態（静止状態）が再生される。 もし酵素がC-Co結合のホモリシスを促進するために25 kcal mol-1を投じて触媒サイクルを開始するなら、このエネルギーは反応シーケンスの終了時に回収されなければならない。 もし、望ましくない転位が起こり、5′-デオキシアデノシルラジカルよりも熱力学的に安定なラジカルが生成されると、エネルギーの回収は不可能である。 したがって、酵素はアルキルラジカルが低エネルギーの中間体に転位したり、タンパク質の足場を移動して触媒作用に関与できない安定なラジカルを形成するのを阻止しなければならない55

常磁性種は、酵素-基質複合体中にすべての反応成分が存在するまで形成しないが、基質不在で補酵素由来のラジカルを形成すると不要な副反応を引き起こす恐れがある。 メチルマロニル-CoAムターゼを用いたEPR実験46,55では、CoC結合のホモリシスは基質添加後にのみ起こり、生成物様のEPR信号が現れることが確認されている。同様に、エタノールアミンアンモニアリアーゼのストップフロー分光測光実験では、酵素とコエンザイムに飽和レベルの基質を結合した後、可視スペクトルにコブ（II）アラミンのサインが現れることが確認されている56。-59

光分解、熱分解、酵素によるアデノシルコバラミンCoC結合のホモリシスにより、コブ(II)アラミンと5′-deoxyadenosyl radicalからなる一重項ラジカル対が生成する。60, 61 これらのプロセスはすべて同じラジカル対の生成につながるため、光分解研究の反応ダイナミクスからの情報は提案された酵素反応機構と関連づけることが可能である。 アデノシルコバラミンの光分解は、コリン環の電子的なπ→π*プロモーションから始まり、CoC結合のホモリシスに至るまでに中間電荷移動状態を含む必要がある60,61。 アデノシルコバラミンのピコ秒光分解研究では、ジェミネイトラジカル対の再結合速度が109 s-1で、分数ケージ再結合効率Fcが約94%であることが明らかになった42, 62-64 コバラミンのナノ秒および連続波の光分解研究では、ジェミネイトケージで効率的にラジカル対の再結合が行われ、全体の光化学量子収率がアデノシルコバラミンで約20%、メチルコバラミンで約35%であることを確認している65,66。 酵素がない場合、ジェミネートラジカル対の大部分は、拡散分離が起こる前に再結合してしまう。 5′-デオキシアデノシルラジカルを安定化し、触媒作用を促進するためには、酵素はおそらく構造変化によりラジカル対の分離距離を増大させなければならない。 どのようなメカニズムであれ、ラジカル対のジェミネイト再結合率が高いことから、酵素の機能の1つは、ラジカルを分離するか、ラジカルの一方を一時的に捕捉して早期の再結合を防ぐことであると考えられる。

得られた一重項{5′-deoxyadenosyl radical:cob(II)alamin} ラジカル対は同一の電子状態であるが、CoC結合の酵素的ホモリシスは励起電子状態にアクセスできず、別のプロセスから始めてCoC結合を弱め平衡を解離方向に転換しなければならない（セクション 5.11.2 を参照のこと）。 ひずみによる開裂はCoC結合のホモリシスをもたらすだけでなく、ひずみの成分が頂点のコバルト軸に沿って起こる場合、このプロセスはラジカルペアの分離距離を増加させることになる。 このようにCoC結合を引き伸ばすブルートフォースアプローチは、ホモリシスとラジカル対再結合速度の純減の両方を達成する最も効率的な方法かもしれない。

また、酵素がCoC結合を強化し、頂点のCo-α-N相互作用を圧縮することによってホモリシスを不利にすることが可能であった。 68 α軸塩基としてピリジンを用いた場合，CoC結合が強く，CoN結合距離は短くなることが観察された． CoC結合が強いと、ヘテロ分解が優先される経路に大きくシフトする。 このモデル系では、研究対象の酵素であるメチルマロニル-CoAミューターゼはCoC heterolysisを防ぐか、heterolysis経路をたどる必要がある。68

メチオニン合成酵素では、コバラミンのコリン部分は27 kDaの断片の二つのドメイン間に挟まれて、C末端のドメインの残余が形成する深いポケットへヌクレオチドの尾が入り込んでいる7、69、70。 この配列は、拡張した親水性セグメントに挟まれた中程度の疎水性の領域を含んでいる。71 コリン環と界面するドメイン間には、構造的な類似性が予想される。 メチオニン合成酵素やメチルマロニルCoAムターゼでコリング下半分を結合し、拡張したヌクレオチドテール（ホスホジエステル部位と5,6-ジメチルベンズイミダゾール基）を収容するα/βドメインはグルタミン酸ムターゼでも期待される（下図）

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