VIRAL PLAQUE ASSAY

Materiali:

30ml di coltura esponenziale di cellule SF9 a 5×105 cellule/ml

6 piastre (2 ciascuna)

1 bottiglia di gel di agarosio al 4%

1 bottiglia di SF-900 (1.3X) medium

1bottiglia sterile

0.5ml surnatante di baculovirus

100ml SFM

1. In condizioni sterili dispensare 2 ml di sospensione cellulare per pozzetto.

2. Consentire alle cellule di stabilirsi sul fondo della piastra e incubare, coperto, a RT per 1 ora.

3. Mettere la bottiglia di gel di agarosio nel bagno d’acqua 70oC. Posizionare il emptybottle e il SF-900 (1.3X) nel bagno 40oC.

4. Following1h incubazione delle piastre a RT, osservare monostrati sotto il microscopio invertito per confermare l’attaccamento delle cellule e il 50% confluenza.

5. Producean otto-log diluizione seriale del surnatante virale raccolto da sequentialdiluting 0,5 ml della diluizione precedente in 4,5 ml di mezzo SFM in 12-mldisposable. Si dovrebbe concludere con 8 tubi contenenti ciascuno di un 10-1 a 10-8 diluizione del brodo virus originale.

7. Sequentiallyremove il surnatante da ogni pozzo, scartare, e sostituire immediatamente con 1 ml della diluizione rispettivo virus a ciascun pozzo duplicato. Incubare per 1h atRT.

8. Movebottles da bagni d’acqua alla cappa sterile quando agarosio ha liquido (20 a 30 min).Quickly dispensare 30 ml del SF-900 (1.3X) medio e 10 ml del 4% agarosegel alla bottiglia vuota e mescolare delicatamente. Restituire il flacone di plaquing overlayto il bagno d’acqua 40oC fino all’uso.

9. Dopo questa seconda incubazione di 1 ora, restituire il flacone di agarosio diluito e le piastre da 6 pozzetti al cappuccio.

10.Sequenzialmente (da alta a bassa diluizione) rimuovere il virus dai pozzetti e sostituire con 2 ml di agarosio diluito. Una pipetta Pasteur collegata a una pompa a vuoto rimuove facilmente le tracce di inoculo.

11.Lasciare indurire il gel per 10-20 minuti prima di muoversi.

12.Incubare a 27oC in un’incubatrice umidificata per 4-10 giorni.

13.Il Recombinantvirus produce placche lattiginose/grigie di leggero contrasto visibili senza colorazione o altri metodi di rilevamento.

14.Monitorare le placche ogni giorno fino a quando il numero di placche contate non cambia per due giorni consecutivi.

15.Determinare il titolo dell’inoculo impiegato, un intervallo ottimale per contare è 3 a20 placche per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Il titolo (pfu/ml) può essere calcolato con la seguente formula:

16. Sovrapposizione di agarosio con colorante Natural Red:

Preparare una soluzione di agarosio allo 0.5% in SFM

Aggiungere la soluzione Natural Red ad una concentrazione finale di 50mg/ml (diluire 3.33mg/ml stock 1:66.6).

Soprapporre 1ml della soluzione di colorante ad ogni pozzetto (su una piastra a 6 pozzetti).