Synaptic Inhibition

VII γ-Aminobutyric Acid and Glycine Receptor Channels

Synaptic inhibition in the central nervous system (CNS) is mediated largely by GABAA and glycine receptors. Questi canali recettoriali ligando-gated sono selettivamente permeabili agli anioni, principalmente Cl- in condizioni fisiologiche. I canali Cl- GABA-gated sono designati recettori GABAA per distinguerli dal recettore GABAB accoppiato alla proteina G (Padgett e Slesinger, 2010). I recettori GABAA e glicina sono membri della famiglia dei recettori Cys-loop. A differenza di altri recettori Cys-loop dei mammiferi che sono canali cationici non selettivi, i canali GABAA e glicina sono selettivamente permeabili agli anioni.

Pirtualmente tutti i neuroni del SNC hanno recettori GABAA, mentre la distribuzione anatomica dei recettori della glicina è generalmente limitata al tronco cerebrale e al midollo spinale. I recettori GABAA sono spesso localizzati sui dendriti prossimali dei neuroni centrali, ma sono anche espressi sui segmenti iniziali degli assoni e sui dendriti distali. Poiché il potenziale di equilibrio Cl- in molti neuroni è più negativo del potenziale di riposo, l’apertura dei canali GABAA o glicina iperpolarizza il potenziale della membrana cellulare e riduce l’eccitabilità. Oltre a iperpolarizzare il potenziale di membrana, l’apertura di un gran numero di questi canali abbassa la resistenza elettrica di membrana. Così i canali GABAA ai dendriti prossimali “smistano” efficacemente l’eccitazione che viaggia lungo il dendrite dalle sinapsi eccitatorie sui rami dendritici più distali. In alcuni neuroni, in particolare durante il primo sviluppo, l’equilibrio Cl- è più positivo del potenziale di riposo, con conseguente depolarizzazione delle risposte GABAA o glicina. Le risposte depolarizzanti GABAA che si verificano negli assoni possono aumentare l’eccitabilità e il rilascio di neurotrasmettitori. Infine, alcune sinapsi inibitorie nel midollo spinale e nel tronco cerebrale contengono sia recettori GABAA che glicine. L’analisi degli eventi di rilascio unitario in questi siti indica che singole vescicole sinaptiche contengono sia GABA che glicina e che una sottopopolazione di siti postsinaptici contiene entrambi i tipi di recettori (Jonas et al., 1998). Come per altri recettori neurotrasmettitoriali ligando-gated, gli studi molecolari hanno rivelato proteine di ancoraggio e di regolazione che interagiscono con i recettori della glicina e del GABAA, come la gefirina (Fritschy et al., 2008) e la proteina associata al recettore GABA (GABARAP; Mohrluder et al., 2009). La gefirina è stata identificata come una proteina citoplasmatica che interagisce direttamente con i recettori della glicina. La gefirina interagisce anche con la tubulina e la proteina profilina legata all’actina e quindi agisce come un ponte tra i recettori della glicina e il citoscheletro. La gefirina è anche co-localizzata con i recettori GABAA nei siti postsinaptici ma, a differenza dei recettori della glicina, non ha dimostrato di legarsi ai recettori GABAA. GABARAP interagisce con molti sottotipi di recettori GABAA, oltre a legarsi alla gefirina e alla tubulina. L’interazione con questi fattori citoplasmatici può alterare la localizzazione e il traffico dei recettori GABAA e glicina e creare zone di trasduzione localizzata del segnale.

Il comportamento dei singoli canali GABAA e glicina può essere descritto da uno schema cinetico simile a quello del nAChR con il legame di due molecole agoniste richiesto per l’apertura del canale (Macdonald e Twyman, 1992). L’analisi delle aperture e delle chiusure dei singoli canali GABAA suggerisce che il canale può aprirsi brevemente in seguito al legame di una singola molecola GABAA e in due stati aperti di più lunga durata dalla configurazione doppiamente legata. Il confronto della durata aperta totale dei recettori a legatura singola e doppia dimostra che l’occupazione di entrambi i siti agonisti si traduce in molte più aperture dei canali. I canali possono chiudersi e rientrare in stati aperti più lunghi prima che l’agonista si dissoci dal recettore. Questi cosiddetti burst sono composti da brevi chiusure che interrompono una serie di aperture e possono durare decine di millisecondi. La desensibilizzazione dei canali GABAA provoca lunghi intervalli chiusi che sono raggruppati con i burst in cluster che durano fino a diverse centinaia di millisecondi. Questi gruppi sono importanti nel determinare la durata dei potenziali postsinaptici inibitori in alcune sinapsi (Jones e Westbrook, 1996).

I farmaci che agiscono sui canali GABAA e glicina comprendono un affascinante e ricco assortimento di composti clinicamente importanti (Olsen et al., 1991). Poiché questi canali sono alla base dell’inibizione sinaptica nel sistema nervoso centrale, l’aumento o la riduzione della loro attività può portare a profondi cambiamenti nelle funzioni cerebrali, compresa l’amnesia (aumento dell’attività GABAA) o le convulsioni (diminuzione dell’attività GABAA). Gli antagonisti per questi recettori includono la stricnina, che inibisce i recettori della glicina; la bicucullina, che inibisce i recettori GABAA; e la picrotossina, che inibisce entrambi i tipi di recettori. Il recettore GABAA è anche il bersaglio dei farmaci sedativi-ipnotici, come le benzodiazepine e i barbiturici. Le benzodiazepine (BDZ) aumentano la probabilità di apertura del canale, mentre i barbiturici sembrano agire prolungando lunghe aperture del canale (burst). La farmacologia della modulazione delle benzodiazepine del recettore GABAA è particolarmente interessante, perché i composti possono aumentare l’apertura del canale (agonisti BDZ), ridurre l’apertura del canale (agonisti inversi BDZ) o bloccare gli effetti degli agonisti BDZ (antagonisti BDZ). L’attività dei recettori GABAA è modulata anche dall’alcol, dagli anestetici volatili, come l’isoflurano, e da alcuni anestetici steroidei (o dai loro equivalenti endogeni, i neurosteroidi).

Utilizzando benzodiazepine e stricnina come ligandi selettivi, i recettori GABAA e glicina sono stati purificati come complessi proteici multimerici, ciascuno con peso molecolare di circa 50-60 kDa. Il complesso del recettore solubilizzato aveva un peso molecolare di circa 250 kDa, suggerendo che, come per l’AChR, cinque subunità costituiscono un recettore. Il successivo clonaggio molecolare ha identificato una serie di subunità recettoriali per entrambi i recettori. Le subunità della glicina includono la subunità legante la stricnina (α) di cui quattro sono state clonate e una singola subunità β, con una stechiometria di (α)2(β)3 per recettori di animali maturi. È interessante notare che la forma immatura del recettore della glicina contiene solo subunità α. La gefirina si lega alla subunità β, quindi l’interazione tra gefirina e recettori della glicina è limitata alla forma adulta. Diciannove subunità GABAA sono state identificate e raggruppate secondo la somiglianza di sequenza. Queste includono sei subunità α, tre β, tre γ, tre ρ e singoli sottotipi δ, ɛ, π e Θ (Wisden e Seeburg, 1992; Olsen e Sieghart, 2009). In sistemi eterologhi, l’espressione di singole subunità del recettore GABAA o della glicina può portare a recettori omomerici funzionali. Tuttavia, dato l’ampio modello di co-espressione di molte subunità dei recettori GABAA e glicina e l’eterogeneità funzionale dei recettori nativi, i recettori omomerici probabilmente si verificano raramente. Il gran numero di subunità del recettore GABAA fornisce una sfida formidabile nel determinare quali combinazioni formano recettori funzionali nei neuroni. L’espressione delle subunità dei recettori GABAA e glicina varia anche durante lo sviluppo e con il tipo di cellula neuronale. Sulla base della farmacologia, dell’espressione, della biochimica e della localizzazione subcellulare, almeno 26 tipi diversi di recettori GABAA nativi sono stati identificati nei neuroni del SNC (Olsen e Sieghart, 2009).

La composizione delle subunità può avere una forte influenza sulle proprietà biofisiche e farmacologiche dei recettori GABAA e glicina. I siti di legame del GABA e delle benzodiazepine risiedono all’interfaccia tra una subunità α e una subunità β o γ (solitamente γ2), rispettivamente. La subunità γ2 è ampiamente e altamente espressa nel SNC e la delezione genetica riduce notevolmente i siti di legame BDZ nel cervello. È interessante notare che la subunità α6 ha una bassa affinità per gli agonisti BDZ, ma può ancora legare BDZ agonisti inversi o antagonisti, il che può spiegare i recettori GABAA insensibili alle benzodiazepine in alcuni neuroni. I recettori omomerici composti dalla subunità ρ del recettore GABAA sono insensibili alla bicuculina, debolmente antagonizzati dalla picrotossina e insensibili alle BDZ, ai barbiturici e ai neurosteroidi. Questi canali mostrano anche proprietà di gating e conduttanze distinte rispetto ad altri recettori GABAA. Sono stati inizialmente indicati come recettori GABAC. Tuttavia, a causa della loro somiglianza di sequenza e della struttura proposta, sono attualmente considerati come un sottotipo di recettori GABAA. Le tre subunità ρ (ρ1, ρ2 e ρ3) sono espresse in tutto il SNC, ma l’espressione è prevalentemente in diversi tipi di cellule della retina.