Saggi di luciferasi

Comprendere come un promotore o un elemento di risposta possa controllare l’espressione genica è più facile se studiato con un gene reporter. Gli enzimi luciferasi sono ideali per i saggi reporter con una semplice rilevazione basata sulla luce e un’alta sensibilità che può quantificare anche piccoli cambiamenti nell’espressione. Mentre i saggi reporter sono spesso usati per valutare i cambiamenti nell’attività del promotore, possono anche essere usati per studiare la trasduzione del segnale, la funzione della proteina, la regolazione del miRNA e anche la misurazione in tempo reale dei processi negli organismi viventi.

La base di un saggio reporter è il vettore, che porta il gene reporter, e i reagenti di rilevamento che forniscono un substrato per convertire l’attività dell’enzima luciferasi in un segnale luminoso. I reagenti per la rilevazione della luciferasi duale estinguono il primo segnale del reporter prima di leggere il secondo per consentire la misurazione sequenziale di due reporter dallo stesso campione. Il secondo reporter è spesso incluso come controllo interno per dati più accurati.

Una volta che il vettore reporter è selezionato e qualsiasi elemento clonato (se necessario), il vettore viene introdotto in cellule coltivate, in genere utilizzando metodi basati sulla trasfezione, espresso e l’attività rilevata con reagenti litici (end-point) o reagenti live-cell per misurare i cambiamenti nelle stesse cellule nel tempo. I saggi di luciferasi reporter possono essere multiplexati con altri saggi per valutare l’apoptosi, il metabolismo e altro. La misurazione dei saggi della luciferasi è tipicamente eseguita utilizzando un luminometro basato su piastra.