Proprietà fisico-chimiche di nanoemulsioni a base di lecitina ottenute per emulsione spontanea o omogeneizzazione ad alta pressione

ARTIGO

Proprietà fisico-chimiche di nanoemulsioni a base di lecitina ottenute per emulsione spontanea o omogeneizzazione ad alta pressione

Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Nanoemulsioni composte da un nucleo di olio di trigliceridi a catena media stabilizzato da lecitine di colza o girasole sono state preparate mediante emulsificazione spontanea e omogeneizzazione ad alta pressione. Queste nanoemulsioni sono state confrontate con formulazioni stabilizzate da lecitina d’uovo. Le nanoemulsioni ottenute per omogeneizzazione ad alta pressione mostrano gocce di dimensioni maggiori (da 230 a 440 nm) rispetto a quelle ottenute per emulsione spontanea (da 190 a 310 nm). I potenziali zeta delle emulsioni erano negativi e inferiori a -25 mV. L’inversione del potenziale zeta si è verificata tra pH 3.0 e 4.0. I risultati dimostrano la fattibilità della preparazione di emulsioni lipidiche comprendenti lecitine di colza o di girasole mediante emulsificazione spontanea e omogeneizzazione ad alta pressione.

Keywords: nanoemulsione; lecitina; parenterale; omogeneizzazione ad alta pressione; emulsificazione spontanea.

INTRODUZIONE

Un regime di nutrizione parenterale è fondamentalmente composto da macronutrienti (aminoacidi, carboidrati e lipidi) e micronutrienti (vitamine, elettroliti e microelementi), sotto la prescrizione di un medico a seconda delle condizioni, dell’età e del peso del paziente.1 I macronutrienti lipidici, somministrati come emulsioni, sono donatori di energia, fornitori di acidi grassi essenziali e portatori di vitamine liposolubili. Gli acidi grassi contenuti in queste formulazioni hanno una grande importanza metabolica, poiché sono componenti della membrana cellulare e svolgono ruoli specifici nella segnalazione e nel trasporto ormonale. Inoltre, sono precursori di prostaglandine, leucotrieni, trombossani e prostacicline, che modulano i processi infiammatori, la funzione renale e l’aggregazione piastrinica.2 Una carenza di acidi grassi essenziali nei neonati pretermine durante lo sviluppo del cervello si traduce in problemi di apprendimento e compromissione della funzione visiva, che può essere irreversibile, anche se una dieta adeguata contenente acidi grassi è fornito più tardi nello sviluppo.2

Le emulsioni lipidiche sono sistemi eterogenei, costituiti da una fase oleosa dispersa omogeneamente in una fase acquosa (disperdente), grazie alla presenza di un emulsionante. Una piccola dimensione delle gocce, di solito tra 200 e 500 nm, caratterizza le formulazioni, a causa del rischio di embolia dovuto all’uso di particelle più grandi. Le emulsioni devono anche mostrare un pH fisiologicamente compatibile (intorno a 7), isotonicità, bassa viscosità e un alto potenziale zeta (in modulo), per evitare il verificarsi di fenomeni di instabilità.3

Le nanoemulsioni lipidiche sono comunemente impiegate nelle miscele per la nutrizione parenterale totale, note come sistemi 3-in-1, in cui tutti i macronutrienti e micronutrienti sono aggiunti a una sacca di etilvinilacetato (EVA). Tuttavia, queste miscele sperimentano una certa instabilità fisica legata alla presenza di elettroliti e altri componenti, che possono precipitare o interagire con le gocce dell’emulsione. La precipitazione di calcio e fosfato è ampiamente riportata in letteratura. Inoltre, gli ioni divalenti (come calcio e magnesio) possono interferire con il potenziale zeta dell’emulsione e indurre l’aggregazione/flocculazione delle goccioline di lipidi, seguita dalla coalescenza. Questo fenomeno è molto grave, perché qualsiasi goccia di diametro superiore a 5 µm che entra nel flusso sanguigno può causare un’embolia grassa.4,5

Le caratteristiche fisiche e la conseguente stabilità delle emulsioni lipidiche sono fortemente legate al loro metodo di produzione e alla loro composizione.3,6 I metodi di produzione sono diversi e possono richiedere più di un passaggio per produrre un’emulsione con una dimensione ridotta delle gocce. Un omogeneizzatore ad alta velocità (Ultraturrax®) può prima creare un’emulsione grossolana, per esempio. La riduzione delle dimensioni delle gocce può quindi essere ottenuta mediante omogeneizzazione ad alta pressione, microfluidizzazione o ultrasuoni.7-9 Tra i metodi che non richiedono pre-trattamento è l’emulsificazione spontanea, utilizzata principalmente negli studi di formulazione e facilmente eseguita su scala di laboratorio, perché non è necessario utilizzare attrezzature sofisticate.10

La tabella 1 mostra la composizione delle tipiche emulsioni lipidiche intravenose disponibili in commercio. Oltre ai componenti descritti, le formulazioni devono soddisfare i requisiti dei prodotti iniettabili.11

La fase oleosa delle emulsioni parenterali è composta da trigliceridi a catena lunga (LCT), che possono essere combinati con trigliceridi a catena media (MCT), come mostrato nella tabella 1. Gli LCT comprendono un’ampia varietà di oli, come l’olio di girasole, di ricino, di oliva o, più comunemente, di soia. Questi oli contengono tutti catene di acidi grassi più lunghe di 12 carboni. Gli MCT sono ottenuti per esterificazione degli acidi grassi dell’olio di cocco. Gli emulsionanti di scelta per la stabilizzazione dell’emulsione iniettabile sono le lecitine, poiché sono biocompatibili e biodegradabili. Le lecitine sono miscele naturali di fosfolipidi polari e neutri, ottenute da fonti animali o vegetali.12 La composizione fosfolipidica delle lecitine da fonti vegetali può essere variabile a causa dell’estrazione, del raccolto e di altre condizioni di lavorazione.13 Esse contengono principalmente fosfolipidi anfoteri, come la fosfatidilcolina e la fosfatidiletanolamina, ma possono essere presenti anche fosfolipidi negativi.

Le emulsioni lipidiche disponibili in commercio per la nutrizione parenterale sono più spesso composte da lecitina di tuorlo d’uovo o, raramente, da lecitina di soia (Solipid® E&S). Nonostante i numerosi benefici dell’integrazione di grassi, ci sono rapporti di effetti clinici avversi legati all’integrazione a lungo termine, a causa di limitazioni metaboliche e reazioni immunitarie in pazienti critici.14,15 Le reazioni avverse alle emulsioni lipidiche parenterali sono riportate essere legate alla presenza di lecitine di soia e di tuorlo d’uovo.16-18 Le interazioni tra farmaci e allergie alimentari possono portare a una serie di risposte avverse, dai disturbi gastrointestinali all’anafilassi.19

In questo contesto, la ricerca di materie prime alternative continua per trovare sostituti ipoallergenici che siano più sicuri per la somministrazione parenterale nei pazienti. Questo lavoro dà la priorità alla ricerca di diverse lecitine con lo scopo di trovare nuove alternative per le emulsioni lipidiche destinate alla nutrizione parenterale, o anche come trasportatori di farmaci, per fornire le opzioni più sicure per i pazienti (soprattutto i neonati pretermine) con ipersensibilità agli emulsionanti a base di uova o soia. Abbiamo cercato di sviluppare nanoemulsioni lipidiche parenterali stabilizzate da lecitine di colza o di girasole, e le abbiamo confrontate con nanoemulsioni contenenti lecitina d’uovo. Inoltre, la preparazione tramite emulsificazione spontanea è stata confrontata con l’omogeneizzazione ad alta pressione, comunemente utilizzata per la produzione industriale di emulsioni lipidiche parenterali.

MATERIALI E METODI

Prodotti chimici e reagenti

MCT, olio di soia e tuorlo d’uovo (Lipoid E80®), lecitine di colza (Lipoid R100®) e girasole (Lipoid H100®) sono stati ottenuti da Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Germania), che ha gentilmente donato le lecitine di colza e girasole. Il glicerolo e l’etanolo sono stati ottenuti rispettivamente da Merck (Brasile) e Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L’acqua ultrapura è stata ottenuta da un apparecchio Milli-Q® (Millipore, Billerica, USA).

Preparazione di nanoemulsioni

Le emulsioni lipidiche sono state preparate in triplicato con due metodi: emulsificazione spontanea e omogeneizzazione ad alta pressione. Le formulazioni ottenute per emulsificazione spontanea sono state preparate secondo una procedura precedentemente descritta.10,20 In breve, l’olio di soia è stato mescolato con MCT, lecitina ed etanolo. Il glicerolo è stato sciolto in acqua, in cui la fase etanolica è stata aggiunta lentamente sotto moderata agitazione magnetica per 30 minuti. Il solvente è stato poi rimosso per distillazione a pressione ridotta in un evaporatore rotante. Le formulazioni ottenute con l’omogeneizzazione ad alta pressione sono state preparate come precedentemente descritto.21 In primo luogo, la lecitina è stata dispersa in acqua contenente glicerolo e mescolata sotto agitazione magnetica a 40 ºC, fino ad ottenere una fase acquosa omogenea. La fase oleosa consisteva in olio di soia e MCT. Entrambe le fasi olio e acqua sono state mescolate sotto agitazione magnetica (15 min, a temperatura ambiente) per ottenere un’emulsione grossolana. Le emulsioni grossolane sono state poi mescolate a 9500 rpm per 2 min usando un mixer IKA® Ultra-Turrax T8 (IKA® Works Inc., NC, USA) per formare pre-emulsioni grezze, che sono state sottoposte individualmente all’omogeneizzazione ad alta pressione (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Canada) a 750 bar (10 000 psi) per 10 cicli per produrre l’emulsione finale. Il valore del pH di tutte le formulazioni è stato regolato a 8,0 con una soluzione di 0,01 mol L-1 NaOH. Le emulsioni sono state conservate a 4 ºC. Le formulazioni e i loro costituenti sono riportati nella tabella 2.

Caratterizzazione fisico-chimica delle nanoemulsioni

I valori di pH delle formulazioni sono stati determinati direttamente nei campioni subito dopo la preparazione, usando un potenziometro calibrato (Digimed, San Paolo, Brasile) a temperatura ambiente. La dimensione media delle gocce e l’indice di polidispersità sono stati misurati con la spettroscopia di correlazione fotonica (PCS) e il potenziale zeta è stato determinato dalla mobilità elettroforetica, usando un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, UK) a 25 ºC. Per queste misure, le nanoemulsioni sono state diluite in una soluzione di NaCl 1 mmol L-1 nell’intervallo di pH da 2.0 a 8.0 unità. La viscosità è stata valutata mediante viscometria capillare a 25 ºC (costante del viscosimetro, k = 0,0212), a 25 ± 0,1 ºC. Il tempo è stato registrato, in secondi, per lo scorrimento del liquido dal segno superiore a quello inferiore in un tubo capillare. Tutte le formulazioni sono state analizzate in triplicato.

Analisi morfologica

L’esame morfologico è stato condotto mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Una goccia della nanoemulsione è stata posta su una griglia di rame rivestita di carbonio (200 mesh), colorata in negativo con una soluzione di acetato di uranile al 2,0% e lasciata asciugare per 24 ore prima dell’esame. È stato utilizzato uno strumento JEM-1200 EXII (JEOL, Tokio, Giappone), funzionante a 80 kV.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Nel presente studio, sviluppiamo emulsioni lipidiche destinate alla nutrizione parenterale o al trasporto di farmaci, stabilizzate da due lecitine ottenute da fonti vegetali (colza (R) e girasole (S)), come alternative alla lecitina di tuorlo d’uovo (E), uno stabilizzatore tradizionale per emulsioni parenterali. Per confrontare le nuove formulazioni con quelle tradizionali, tutti gli altri componenti dell’emulsione sono stati mantenuti a concentrazioni simili a quelle dei prodotti commerciali dell’emulsione lipidica. Questo lavoro confronta anche due diversi metodi di produzione: emulsificazione spontanea e omogeneizzazione ad alta pressione.

La tabella 3 presenta le proprietà fisico-chimiche delle nanoemulsioni risultanti. Le formulazioni ottenute per emulsificazione spontanea mostrano una dimensione media delle gocce da 220 a 300 nm, come determinato da PCS. In teoria, questo è un intervallo di alta stabilità dell’emulsione.11,22,23 Come la dimensione della goccia è ridotta, il tasso di auto-diffusione aumenta fino ad un punto in cui gocce molto piccole possono essere tenuti da cremare da miscelazione diffusionale.7,23 Nanoemulsioni contenenti lecitina di colza o girasole mostrano una dimensione più piccola goccia media rispetto a quelli contenenti lecitina tuorlo d’uovo. Risultati simili sono stati descritti per le nanoemulsioni ottenute con lo stesso metodo, composte esclusivamente da MCT, come fase oleosa, e stabilizzate dal 2% (m/m) di lecitina d’uovo.24 Sulla base di questi dati, si potrebbe concludere che la concentrazione del 1,2% sarebbe sufficiente per emulsionare la miscela di olio di soia, MCT e acqua. Tuttavia, anche se sono state ottenute piccole dimensioni delle gocce e un basso indice di polidispersità, le emulsioni non sono rimaste fisicamente stabili per più di una settimana dopo la preparazione, in seguito alla quale è stato possibile osservare visivamente la separazione di fase (coalescenza). Il processo di coalescenza è un fenomeno di instabilità irreversibile, poiché le goccioline di olio perdono le loro interfacce e si fondono in goccioline più grandi.25

La composizione qualitativa e quantitativa delle nanoemulsioni, oltre al tipo di emulsionante e al metodo di emulsificazione, può influenzare direttamente la dimensione delle goccioline.7,23 Un secondo metodo è stato quindi testato per la preparazione della nanoemulsione. L’omogeneizzazione ad alta pressione è comunemente usata nell’industria farmaceutica per la produzione di tali formulazioni, anche se su scala industriale. Tra i vari metodi disponibili per l’emulsificazione, questo metodo è preferito per la sua efficiente distruzione delle gocce. Si tratta di un metodo ad alta energia, in cui la riduzione delle dimensioni si ottiene forzando un’emulsione grossolana sotto alta pressione attraverso una valvola omogeneizzante, deformando e riducendo così le dimensioni delle gocce.26 L’emulsificazione spontanea è un metodo a basso costo, facile e affidabile, e viene solitamente utilizzato negli studi sperimentali al posto di un omogeneizzatore ad alta pressione, che è molto più complesso e costoso.

Come dimostrato nella tabella 3, l’omogeneizzazione ad alta pressione ha prodotto dimensioni delle gocce più grandi in nanoemulsioni comprendenti lecitina di colza (296 ± 18 nm) o di girasole (417 ± 25 nm), rispetto al metodo precedente, e rispetto alle emulsioni di controllo uova-lecitina (243 ± 12 nm). Tuttavia, va sottolineato che, anche se l’omogeneizzazione ad alta pressione era meno efficiente nella rottura delle gocce, ha conferito maggiore stabilità alle formulazioni. Contrariamente alle emulsioni ottenute per emulsificazione spontanea, queste erano visivamente stabili per almeno 30 giorni. Questi risultati confermano l’importanza del metodo di preparazione nel conferire stabilità all’emulsione.

Considerando le applicazioni intravenose, la distribuzione delle dimensioni delle goccioline di emulsione lipidica può essere ancora più importante della dimensione media delle goccioline. Una piccola popolazione di grandi goccioline di olio può essere sufficiente a causare un’embolia grassa nei pazienti.4,5 Le distribuzioni delle dimensioni delle goccioline delle formulazioni preparate sono presentate nella Figura 1.

Nella Figura 1, si osservano due popolazioni nelle formulazioni composte da lecitina di colza (ottenuta per emulsione spontanea, Figura 1C) e lecitina di girasole (ottenuta per emulsione spontanea o per omogeneizzazione ad alta pressione, Figure 1E e 1F). Come risultato, un indice di polidispersità superiore a 0,20 è ottenuto per queste formulazioni.

La stabilità delle emulsioni può essere correlata alla composizione e alle proprietà del loro film interfacciale (lecitina), poiché questo determina il potenziale zeta delle formulazioni e la repulsione tra le goccioline, che è uno dei meccanismi di stabilizzazione dell’emulsione.27 La lecitina è una miscela eterogenea di fosfolipidi; la sua eterogeneità è estremamente vantaggiosa a causa della fluidità del film interfacciale, se paragonata a quella di un fosfolipide puro.28 I principali fosfolipidi delle miscele di lecitina sono la fosfatidilcolina e la fosfatidiletanolamina, che sono senza carica a pH fisiologico (7,4). Possono essere presenti anche piccole quantità di lipidi acidi, come il fosfatidilinositolo, la fosfatidilserina e il fosfatidilglicerolo. Questi lipidi sono ionizzati a pH 7,0 e inducono una carica superficiale negativa sulle goccioline dell’emulsione, che contribuisce alla loro stabilità. Qualsiasi sostanza aggiunta che interferisce con questa carica è probabile che alteri la stabilità del sistema.29 Anche se la lecitina di grado parenterale è altamente purificata, contiene ancora una piccola quantità di altri fosfolipidi, come mostrato nella Tabella 4, che descrive la composizione delle tre materie prime di lecitina utilizzate in questo studio.

Come dimostrato nella Tabella 3, un potenziale zeta più piccolo (valore del modulo) si osserva per le nanoemulsioni composte da lecitina di colza o di girasole e ottenute per emulsificazione spontanea. Tuttavia, non si osservano differenze nei potenziali zeta delle nanoemulsioni prodotte mediante omogeneizzazione ad alta pressione. Questi risultati indicano che il fattore principale che influenza il potenziale zeta è il metodo di preparazione. Anche se il nostro gruppo ha ottimizzato entrambi i metodi, le condizioni sperimentali devono essere solitamente regolate, tenendo conto della composizione delle formulazioni. Parametri come il numero di cicli e la pressione possono essere modificati per ottenere proprietà fisico-chimiche desiderate delle formulazioni finali.30,31

Il potenziale zeta delle nanoemulsioni dipende anche dalla ionizzazione dell’emulsionante. Una riduzione della carica risultante (in modulo) da 40 mV a meno di 25 mV può aumentare i tassi di flocculazione e coagulazione.32 Il potenziale zeta e la dimensione media delle gocce delle nanoemulsioni composte da diverse lecitine e prodotte da diversi metodi di emulsificazione sono stati valutati nell’intervallo di pH da 2.0 a 8.0. I risultati sono presentati nella Figura 2.

La carica superficiale di tutte le formulazioni diminuisce a zero tra il pH 3.0 e 4.0, come precedentemente osservato per Intralipid®, un’emulsione di trigliceridi stabilizzata con lecitina d’uovo.25 Il potenziale zeta dipende dal pH, poiché l’H+ è uno ione che determina il potenziale sulle superfici dei fosfolipidi, con un pH isoelettrico di 3,1.33 Una riduzione del pH determina una diminuzione del potenziale zeta (meno negativo) e una più rapida velocità di flocculazione.34 La dimensione media delle gocce mostra un piccolo aumento al pH di inversione del potenziale zeta. Dalla figura 3, si può concludere che il pH delle nanoemulsioni dovrebbe essere preferibilmente superiore a 7,0, poiché un plateau viene raggiunto a quel valore di pH, dove si osserva la massima repulsione tra le goccioline di olio.

Infine, la morfologia delle goccioline d’olio delle nanoemulsioni preparate tramite omogeneizzazione ad alta pressione è stata esaminata tramite TEM. La figura 3 rivela particelle omogenee e sferiche, mostrando che le gocce dell’emulsione hanno una dimensione media delle gocce nell’ordine dei nanometri. Questi risultati corroborano la precedente analisi delle dimensioni delle gocce.

Le nanoemulsioni sono sistemi a bassa viscosità con comportamento newtoniano. La valutazione della viscosità dell’emulsione è cruciale, poiché la somministrazione intravenosa di emulsioni ad alta viscosità può essere molto dolorosa per il paziente.23,32 Le nanoemulsioni composte da diverse lecitine mostrano viscosità simili. Come previsto, non si osserva alcuna relazione tra la dimensione media delle gocce e la viscosità delle nanoemulsioni, poiché tutte le formulazioni contenevano solo il 10% di nucleo di olio.35 Al contrario, alcune differenze di viscosità sono osservate per le formulazioni ottenute con i diversi metodi di preparazione: l’emulsificazione spontanea ha prodotto emulsioni leggermente più viscose.

Va detto che le composizioni delle nanoemulsioni studiate in questo lavoro sono basate su quelle delle nanoemulsioni commerciali utilizzando la lecitina d’uovo come emulsionante. L’uso di un emulsionante diverso può richiedere l’ottimizzazione della sua concentrazione e/o delle condizioni di emulsificazione. Le nanoemulsioni iniettabili commerciali composte da lecitina di soia (Solipid®) richiedono una concentrazione dell’1,5% dell’emulsionante, per esempio. Ulteriori co-emulsionanti sono talvolta utilizzati per stabilizzare le emulsioni e promuovere una minore polidispersione e gocce più piccole. Tuttavia, la loro applicazione è limitata alle emulsioni lipidiche come trasportatori di farmaci, perché piccole quantità delle formulazioni sono somministrate a tale scopo: i co-emulsionanti non sono frequentemente utilizzati nelle emulsioni per la nutrizione parenterale, a causa degli alti volumi di queste formulazioni somministrate e dei problemi di sicurezza, soprattutto nel caso dei neonati pretermine. L’oleato di sodio è comunemente usato per stabilizzare le formulazioni di emulsioni lipidiche iniettabili,36 agendo come tensioattivo anionico e agente solubilizzante.27

CONCLUSIONI

I risultati dimostrano la fattibilità della preparazione di emulsioni lipidiche iniettabili composte da lecitine di colza o di girasole mediante emulsificazione spontanea e omogeneizzazione ad alta pressione, come alternativa alle tradizionali nanoemulsioni uova-lecitina per pazienti che sono sensibili ai derivati delle uova. Ulteriori studi dovrebbero essere condotti per ottimizzare le condizioni di emulsificazione per migliorare la stabilità a lungo termine delle formulazioni.

Si ringraziano il Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq) per il sostegno finanziario e Lipoid GmbH per i materiali forniti.

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Ricevuto il 03/02/2014; accettato il 17/04/2014; pubblicato sul web il 15/07/2014