Plasmide-Mediato AmpC β-Lattamasi CITM e DHAM Genes Among Gram-Negative Clinical Isolates

Background

La resistenza ai farmaci tra alcuni dei batteri Gram-negativi (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii, e Pseudomonas aeruginosa) è emerso e si è diffuso in tutto il mondo. Tra la famiglia Enterobacterales, Escherichia coli e Klebsiella spp. sono organismi frequentemente isolati che hanno notevoli proprietà di resistenza ai farmaci. I β-lattami sono i farmaci comunemente prescritti contro questi ceppi recalcitranti, e da soli costituiscono circa due terzi delle recenti prescrizioni cliniche.1 Questo gruppo contiene quattro classi chimiche principali: penicilline, cefalosporine, carbapenemi e monobattami, in cui i carbapenemi sono utilizzati come ultima risorsa nella terapia empirica contro ceppi patogeni di batteri Gram-positivi, Gram-negativi e anaerobi.2

La resistenza ai β-lattamici è attribuibile alla produzione di β-lattamasi, quegli enzimi idrolitici che sono in grado di inattivare gli antibiotici prima che raggiungano le proteine leganti la penicillina (PBPs) situate sulla membrana citoplasmatica.3 Le principali famiglie di β-lattamasi comprendono le β-lattamasi a spettro esteso mediate da plasmidi (ESBLs), le AmpC, le cefalosporinasi e le carbapenemasi. Tutte le classi sono state rilevate a livello globale con poche di esse concentrate in paesi specifici.1

I geni che codificano la β-lattamasi AmpC si sono diffusi ampiamente e sono ampiamente rilevati nei plasmidi batterici. La prima variante AmpC codificata su plasmide è stata identificata per la prima volta nel 1989 da Klebsiella pneumoniae isolata in Corea del Sud. È stata chiamata CMY-1 a causa del suo tratto fenotipico associato alla cefamicina ed era notoriamente resistente alla cefoxitina.4,5 In un breve lasso di tempo sono state individuate molte famiglie di varianti AmpC mediate da plasmide, prevalentemente da isolati di K. pneumoniae ed E. coli. I batteri che possedevano genotipi di AmpC mediati da plasmidi sono stati attribuiti sulla base dell’omologia nella sequenza dell’acido nucleico, formando un numero maggiore di generi batterici che hanno agito come fonte di questi plasmidi e un certo numero di famiglie di AmpC.6 Ad oggi, le seguenti famiglie di AmpC sono state riportate a livello globale: due famiglie di β-lattamasi CMY (CMY-1 e CMY-2) isolate rispettivamente da Aeromonas hydrophila e Citrobacter freundii; enzimi di tipo FOX e MOX isolati da Aeromonas spp.la famiglia ACC derivata da H. alvei; la famiglia LAT di cefalosporinasi isolata da C. freundii; le famiglie MIR e ACT originate da Enterobacter spp. e la famiglia DHA isolata da Morganella morganii.4,6,7 La maggior parte dei geni AmpC codificati su plasmide si trova in isolati di E. coli e K. pneumoniae in infezioni nosocomiali, mentre la resistenza tra altri batteri Gram-negativi come E. cloacae, C. freundii, S. marcescens e M. morganii è conferita dalle β-lattamasi AmpC mediate da cromosoma, aumentando così la resistenza alle cefalosporine ad ampio spettro.8 Gli organismi che producono ESBLs spesso caratterizzati dalla co-espressione con AmpC β-lattamasi stanno ponendo una seria minaccia nella diagnosi e nel trattamento dei patogeni.

Inoltre, i geni AmpC β-lattamasi, specialmente MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM e ACCM sono responsabili dello sviluppo della resistenza ad ampio spettro alla maggior parte dei β-lattamici (diversi da cefepime e carbapenemi). Inoltre, l’acquisizione di questi geni nei batteri può aumentare ulteriormente la resistenza perché gli inibitori degli enzimi di classe A (tra cui l’acido clavulanico, il sulbactam e il tazobactam) e il p-cloromercuribenzoato non sono efficaci contro le AmpC β-lattamasi, sebbene alcune di esse possano essere inibite dal tazobactam o dal sulbactam.6

Anche se si fanno sforzi per frenare la crescita e la diffusione di patogeni resistenti ai farmaci, gli studi sulle AmpC β-lattamasi in ambienti con risorse limitate sono ancora inadeguati. Il passo più importante per far fronte alla crescente resistenza antimicrobica (AMR) è l’individuazione precisa dei ceppi patogeni (e/o resistenti) nei laboratori diagnostici. Tuttavia, i protocolli di laboratorio per la segnalazione di routine non riescono a offrire un risultato preciso in Nepal perché le β-lattamasi AmpC sono difficili da identificare con i soli test fenotipici e sono spesso falsamente rilevate come ESBL nei laboratori clinici. Gli isolati Enterobacterales che sono positivi nel test di screening del fenotipo ESBL ma negativi nel test di conferma sono di solito considerati come potenziali produttori di AmpC β-lattamasi conferite dalla depressione cromosomica o dal trasferimento del plasmide.9

Anche i microbiologi clinici esperti non riescono a identificare le AmpC β-lattamasi mediate dal plasmide, suggerendo così la necessità di un metodo più preciso e specifico per la pronta individuazione. Tuttavia, alcune di queste procedure sono ad alta intensità di risorse e spesso richiedono reagenti che non sono facilmente disponibili.10 Per queste ragioni, le AmpC β-lattamasi non vengono rilevate nei campioni clinici. Così, un protocollo di laboratorio più affidabile e valido che consiste nella reazione a catena della polimerasi multipla (PCR) è stato ideato per facilitare la diagnosi dei geni AmpC codificati dal plasmide che è responsabile dell’espressione della β-lattamasi AmpC in varie infezioni cliniche.11

La maggior parte degli studi sono concentrati sulla prevalenza degli enzimi ESBL negli isolati clinici Gram-negativi in Nepal.12-16 Ci sono un numero limitato di studi sugli enzimi AmpC β-lattamasi nei batteri Gram-negativi in Nepal. Uno studio condotto nella valle di Kathmandu ha riportato il 27,8% degli isolati Enterobacterales come produttori di AmpC β-lattamasi usando il metodo fenotipico.17 A nostra conoscenza, ci sono studi limitati relativi al rilevamento e alla caratterizzazione degli enzimi AmpC β-lattamasi nei batteri Gram-negativi usando sia metodi fenotipici che genotipici in Nepal. È essenziale istituire metodi fenotipici e genotipici standard per il test di suscettibilità agli antibiotici al fine di selezionare gli agenti patogeni resistenti ai farmaci negli ospedali. Questo studio è stato intrapreso per isolare e identificare i geni delle β-lattamasi AmpC (blaCITM e blaDHAM) negli isolati batterici Gram-negativi utilizzando sia lo screening fenotipico che i metodi di conferma.

Metodi

Study Design

Questo è uno studio trasversale basato sull’ospedale condotto da giugno 2017 a gennaio 2018 all’Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). Un totale di 1151 campioni clinici non duplicati sono stati raccolti e sono stati elaborati durante il periodo di studio. I campioni includevano urina (n=412), sangue (n=206), punta del catetere (n=163), pus (n=132), feci (n=89), CSF (n=53), tampone della ferita (n=58) e tampone vaginale (n=38). I campioni sono stati ottenuti in un contenitore sterile, ben etichettato e a prova di perdite, e trattati il prima possibile.18 Tutti i pazienti in visita con sospetto di infezioni batteriche che hanno fornito il loro consenso ad essere coinvolti sono stati inclusi nello studio. I partecipanti allo studio con informazioni demografiche inadeguate sono stati esclusi.

Cultura dei campioni e identificazione degli isolati

I campioni sono stati raccolti secondo le linee guida microbiologiche standard per la raccolta di urina, feci, pus, sangue, CSF e punta del catetere. I campioni idonei sono stati ulteriormente inoculati su agar sangue (BA) agar cioccolato (CA) e agar MacConkey (MA). Inoltre, i campioni di urina sono stati inoculati in Chromogenic UTI agar. Gli isolati sono stati identificati utilizzando parametri microbiologici standard come l’aspetto morfologico delle colonie, le reazioni di colorazione e le proprietà biochimiche.19,20

Test di suscettibilità antibiotica

Tutti gli isolati Gram-negativi identificati sono stati ulteriormente sottoposti a test di suscettibilità antimicrobica in vitro utilizzando il metodo di diffusione su disco Kirby-Bauer modificato.21 In primo luogo, gli inoculi sono stati creati trasferendo le colonie batteriche da agar nutriente a soluzione salina normale sterile. La torbidità degli inoculi è stata impostata in equivalenza a 0,5 McFarland standard come indicato dalle linee guida CLSI. La coltura a tappeto degli inoculi di prova è stata preparata anche su agar Muller-Hinton (MHA). I dischi antibiotici (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, India) sono stati utilizzati nelle seguenti proporzioni: amoxicillina (10 μg), azitromicina (10 μg), amikacina (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitina (30 μg), ceftazidime (30 μg), ciprofloxacina (5 μg), imipenem (10 μg), piperacillina/tazobactam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), cotrimoxazolo (25 μg) e cefepime (30 μg). La piastra inoculata è stata incubata aerobicamente a 37°C fino a 18 ore. Dopo un’incubazione sufficiente, sono state misurate le zone di inibizione (ZOI) intorno ai dischi e il risultato è stato classificato come sensibile, intermedio o resistente.21 Gli isolati che mostrano resistenza a tre o più antibiotici di classi diverse sono stati interpretati come multi-farmaco resistenti.22

Screening per le AmpC β-Lattamasi

Gli isolati sono stati innanzitutto sottoposti a screening per la possibile produzione di AmpC β-lattamasi secondo le linee guida CLSI, 2019.23 Per lo screening, ceftazidime o cefotaxime o cefoxitin o ceftriaxone, ciascuno di 30 µg sono stati sottoposti a test AST e gli organismi resistenti a quegli antibiotici (che mostravano zone di inibizione di diametro ≤ 18mm) sono stati vagliati come potenziali produttori di AmpC e sottoposti a ulteriori test di conferma.

Conferma per le β-lattamasi AmpC

I produttori di β-lattamasi AmpC positivi allo screening sono stati confermati dal test del disco AmpC e dal test di conferma basato sugli inibitori (test dell’acido boronico).

Nel test dell’acido boronico, la coltura a tappeto dell’organismo in esame è stata fatta su piastra MHA prendendo soluzioni 0,5 McFarland. Due dischi di cefoxitina (30 µg), uno dei quali è stato aggiunto con acido borico fenilico (400 µg) sono stati posti sulla coltura a tappeto su piastra MHA e incubati e i risultati sono stati interpretati. Se c’è stato un aumento della zona di inibizione di ≥5 mm quando il disco dell’antibiotico desiderato (ceftazidime o cefotaxime) è stato valutato in combinazione con l’acido fenilboronico rispetto al test senza la combinazione (disco dell’antibiotico da solo), l’isolato è stato contrassegnato come avente un test di conferma positivo.

Nel test di approssimazione del disco, i dischi sono stati messi sopra la cultura del tappeto di E. coli ATCC 25922. Il disco di ceftazidima da 30μg è stato messo al centro della piastra seguito da 10μg di imipenem, 30μg di cefoxitina e 20/10μg di amoxicillina/clavulanato che sono stati messi a una distanza di 20mm dal disco di ceftazidima. Le colonie dell’organismo in esame sono state aggiunte a un disco e poi la piastra è stata capovolta e incubata per 24 ore a 37°C aerobicamente. Qualsiasi rientranza o appiattimento dello ZOI indicava la produzione di AmpC β-lattamasi da parte degli isolati.20,24

Conservazione degli isolati positivi all’AmpC β-lattamasi

Per la conservazione è stato utilizzato il metodo di preparazione dello stock di glicerolo. Gli organismi sono stati conservati in Tryptic Soy Broth (TSB) contenente il 40% di glicerolo e conservati a -20ºC.25

Estrazione del DNA plasmidico grezzo

Una colonia isolata dell’organismo in esame è stata inoculata nel brodo Luria Bertani (LB). L’inoculo è stato incubato aerobicamente con un agitatore a bagnomaria a 37°C per 18-24 ore. La coltura pura così ottenuta è stata sottoposta al metodo della lisi alcalina per estrarre il DNA plasmidico. Il DNA plasmidico estratto è stato poi sospeso in tampone TE e conservato a -20°C fino ad ulteriori indagini.26

Amplificazione dei geni delle β-lattamasi AmpC (blaCITM e blaDHAM) mediante PCR

I geni delle β-lattamasi AmpC (blaCITM e blaDHAM) sono stati amplificati mediante PCR usando la preparazione del DNA plasmidico come template. I primer usati per il gene blaCITM erano CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) e CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) come primer forward e reverse rispettivamente, mentre i primer per il gene blaDHAM erano la sequenza forward DHAM per (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) e la sequenza reverse DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ).11 Il volume di reazione è stato fissato a 25µL aggiungendo 12,5µL di master mix 1X (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estonia), 0,5µL ciascuno dei primer forward e reverse e 4µL di DNA template e ddH2O 7,5µL. L’amplificazione PCR ottimizzata di entrambi i geni era 94ºC per 3 minuti per la denaturazione iniziale; 35 cicli di denaturazione a 94ºC per 30 secondi; 25 cicli di annealing a 62ºC per 30 secondi; 35 cicli di estensione a 72º per 1 min; e estensione finale a 72ºC per 7 minuti.11,27

Purificazione del DNA

Il DNA plasmidico è stato purificato con il metodo di precipitazione in etanolo. In questo metodo, il pellet di DNA è stato sciacquato con etanolo al 70% freddo come il ghiaccio e lasciato asciugare per 10 minuti per facilitare l’evaporazione dell’alcol. Il pellet di DNA è stato sospeso in una soluzione tampone contenente Tris, EDTA e RNasi per eliminare le impurità rimanenti.

Rilevamento dei prodotti di PCR mediante elettroforesi su gel

I prodotti amplificati sono stati visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1,5% colorato con 0,1µL di bromuro di etidio. Dopo la preparazione del gel, 2µL di DNA ladder 100bp sono stati aggiunti al primo pozzetto come marker, 2µL di controllo negativo sono stati aggiunti ad un altro pozzetto, 2µL di controllo positivo sono stati aggiunti ad un altro pozzetto e 2µL di prodotti PCR sono stati aggiunti ai pozzetti rimanenti. Infine, il gel è stato visualizzato sotto un transilluminatore UV.28

Controllo di qualità

Una procedura asettica standard è stata adottata per le procedure in questo studio. Tutti i lotti dei mezzi di coltura e dei reagenti chimici sono stati elaborati con tecniche asettiche seguendo le linee guida CLSI. In AST, il controllo di qualità è stato mantenuto utilizzando i ceppi di controllo di E. coli ATCC 25922. Durante la PCR, il controllo di qualità è stato assicurato dall’uso di isolati di Klebsiella portatori di entrambi i geni in questione, mentre i controlli bianchi o negativi sono stati preparati senza l’applicazione di acidi nucleici. Tutti questi controlli sono stati utilizzati in ogni lotto del test PCR.

Analisi statistica

I dati sono stati inseriti e analizzati utilizzando il software SPSS versione 24.0. Le associazioni sono state esplorate usando i test Chi-quadrato al 95% di intervallo di confidenza (CI) tra le variabili demografiche come il sesso e l’età dei soggetti.

Risultati

Carattere demografico e clinico dei pazienti arruolati

Tra i 1151 pazienti arruolati, il 54,2% (624/1151) era maschio e il 45,8% (527/1151) era femmina. Di 253 crescite batteriche, il 47,8% (121/253) erano maschi e il 52,2% (132/253) erano femmine. Del totale (253) crescita batterica, il 26,1% (66/253) proveniva da campioni di urina, seguito da punte di catetere (17,4%; 44/253), sangue (16,2%; 41/253), pus (11,9%; 30/253) e tamponi di ferite (10,7%; 27/253). Sulla distribuzione in base all’età dei pazienti, la più alta crescita di patogeni batterici è stata trovata nel gruppo di età 16-45 anni (39.5%; 100/253) seguita da 46-60 anni (30.1%; 76/253), >60 anni (24.1%; 61/253), e 0-15 anni (6.3%; 16/253) rispettivamente (Tabella 1).

Tabella 1 Caratteristiche demografiche e cliniche dei pazienti che frequentano l’Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Distribuzione degli isolati batterici nei campioni clinici

Tra un totale di 1151 campioni clinici, il 22% (253/1151) ha mostrato una crescita sui terreni di coltura. Dei 253 isolati batterici, la maggior parte (89,3%; 226/253) erano batteri Gram-negativi. Tra la crescita batterica, E. coli (28,5%; 72/253) era l’organismo predominante seguito da Pseudomonas aeruginosa (16,2%; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8%; 40/253), batteri Gram-positivi (10,7%; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9%; 25/253), e Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Figura 1)

Figura 1 Distribuzione dei generi batterici in campioni clinici positivi alla coltura (n=253).

Modello di suscettibilità antibiotica dei batteri Gram-negativi isolati

Su 226 isolati batterici Gram-negativi, il 66.8% (151/226) sono stati trovati resistenti alla cefoxitina, seguita da ceftazidime (58,4%; 132/226), ciprofloxacina (53,5%; 121/226) e cefepime (51.8%; 117/226) mentre gli isolati erano più suscettibili al meropenem (69%; 156/226), ertapenem (68,6%;155/226), imipenem (66,8%; 151/226), amikacina (61,1%;138/226), piperacillina/tazobactam (56,6%;128/226) e azitromicina (53.1%; 120/226) (tabella 2).

Tabella 2 Modello di suscettibilità antibiotica degli isolati batterici Gram-Negativi (n=226)

Modello di resistenza multifarmaco (MDR) negli isolati

Su 226 isolati, il 46.9% (106/226) degli isolati erano MDR. La percentuale più alta di MDR è stata trovata tra E. coli (31,1%; 33/106) seguita da P. aeruginosa (20,8%; 22/106), A. baumannii (18,9%; 20/106), K. pneumoniae (9,4%; 10/106) e K. oxytoca (4,7%; 5/106) rispettivamente (Figura 2). Nelle singole specie, la percentuale più alta di resistenza ai farmaci è stata trovata tra C. freundii (100%; 8/8) seguita da P. aeruginosa (53,6% 22/41), C. koseri (50%; 2/4), A. baumannii (50%; 20/40) ed E. coli (45,8% 33/72), rispettivamente (Figura 2).

Figura 2 Distribuzione dei batteri MDR e % complessiva MDR e MDR all’interno di ogni specie.

Rilevazione di AmpC con vari test

Su 226 isolati Gram-negativi, il 50% (113/226) ha mostrato resistenza alla cefoxitina. Gli isolati produttori di β-lattamasi AmpC sono stati confermati da due diversi test di conferma, Disk test e test dell’acido boronico. Dei novantuno isolati, il 91,2% (83/91) ha mostrato un risultato positivo in entrambi i test e l’8,8% (8/91) ha mostrato un risultato positivo solo nel test dell’acido boronico confermato da almeno un test ed è stato considerato come produttore di AmpC β-lattamasi.

Prevalenza dei geni blaCITM e blaDHAM negli isolati Gram-negativi produttori di AmpC β-lattamasi

Nel test PCR, il 90,1% (82/91) e l’87,91% (80/91) degli isolati sono risultati positivi a blaCITM e blaDHAM. Rispettivamente, sono stati rilevati i geni blaCITM e blaDHAM amplificati con i loro ampliconi di 465 bp e 405 bp (Figure 3 e 4).

Figura 3 Elettroforesi su gel di agarosio (1,5%) usata per la separazione dei prodotti della PCR. Corsia 2, controllo positivo; corsia 3, 5, e 7 sono CITM positivo; corsia 4 e 6, CITM negativo; e corsia 8. controllo negativo.

Figura 4 Elettroforesi su gel di agarosio (1,5%) usata per la separazione dei prodotti PCR. Corsia 2, controllo positivo; corsia 3, 4, 6 e 7 sono Dham positivo; corsia 5, Dham negativo; e corsia 8, controllo negativo.

Distribuzione dei geni AmpC β-Lattamasi, blaCITM e blaDHAM tra gli isolati Gram-Negativi e la loro relazione con il sesso, l’età, i campioni clinici e gli isolati clinici

Su 91 produttori di AmpC, il 50,6% (46/91) degli isolati erano di sesso femminile e il 49,4% (45/91) di sesso maschile. Allo stesso modo, percentuali uguali (50%; 41/82) di geni blaCITM sono stati ottenuti da campioni di entrambi i generi mentre il 51,3% (41/80) e il 48,7% (39/80) dei geni blaDHAM sono stati rilevati nei campioni ottenuti da pazienti maschi e femmine rispettivamente. Non c’era alcuna associazione significativa del sesso del paziente con la produzione di enzimi AmpC e geni AmpC (Tabella 3).

Tabella 3 Distribuzione dei geni AmpC β-lattamasi, CITM e DHAM tra gli isolati batterici Gram-negativi e la loro relazione con il sesso, l’età e i campioni clinici

Il maggior numero di produttori di AmpC β-lattamasi (40.7%; 37/91) e la prevalenza di isolati che producono blaCITM (40,2%; 33/82) e blaDHAM (41,2%; 33/80) sono stati ottenuti dal gruppo di età (46-60) anni seguito da (16-45) anni (30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) e 31,3%; 25/80) rispettivamente. C’era un’associazione significativa tra la produzione dell’enzima AmpC β-lattamasi e il gruppo di età (p=0,01) mentre altri fattori tra cui l’acquisizione dei geni blaCITM e blaDHAM non avevano alcuna associazione significativa con l’età del paziente (Tabella 3).

Tra i campioni clinici, il maggior numero di isolati produttori di AmpC β-lattamasi (20,9%; 19/91) è stato rilevato dal sangue e dalle punte dei cateteri, seguiti da urina (18,7%; 17/91), pus (13,3%; 12/91) e tamponi di ferite (9,9%; 9/91). Allo stesso modo, il maggior numero di isolati che producono blaCITM e blaDHAM sono stati rilevati dalle punte dei cateteri (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80), seguiti da sangue (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80) urina (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) e pus (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80), rispettivamente. Non c’era alcuna associazione significativa tra campioni clinici, produzione di AmpC β-lattamasi e geni: blaCITM e blaDHAM (Tabella 3).

Distribuzione delle β-lattamasi AmpC e acquisizione dei geni blaCITM e blaDHAM in vari batteri Gram-negativi

La più alta prevalenza di enzimi AmpC β-lattamasi è stata trovata in E. coli (28,6%; 26/91), seguito da P. aeruginosa (26,4%; 24/91), A. baumannii (13,2%; 12/91) e K. pneumoniae (10,9%; 10/91). Prevalenza più alta di blaCITM e blaDHAM geni sono stati rilevati in E. coli (30,6%; 25/82) (31,3%; 25/80) seguita da P. aeruginosa (25,7%; 21/82), (22,5%; 18/80) A. baumannii (12,2%; 10/82), (12,4%; 10/80) e K. pneumoniae (10,9%; 9/82), (12,4%; 10/80), rispettivamente (Tabella 3).

Discussione

La crescente incidenza della resistenza antimicrobica rimane come uno dei principali problemi di salute pubblica nei paesi in via di sviluppo come il Nepal29 che ha portato al prolungamento della degenza ospedaliera, all’aumento dei costi di trattamento, alla limitazione delle opzioni terapeutiche e all’aumento della morbilità e della mortalità.29,30 La produzione di β-lattamasi è il principale meccanismo di difesa contro gli antibiotici β-lattamici. Questo studio è stato condotto per esplorare la presenza di β-lattamasi di classe C (AmpC) in organismi Gram-negativi derivati da campioni clinici ottenuti all’ANIAS, Kathmandu, Nepal. Questo studio ha inoltre valutato la prevalenza dei geni delle β-lattamasi AmpC (blaCITM e blaDHAM) mediante saggio PCR. Abbiamo trovato un’alta prevalenza di questi enzimi e geni, anche se la prevalenza di tali enzimi variava da una regione geografica all’altra, all’interno e tra i paesi.

Su 1151 campioni clinici, solo 253 (21,9%) hanno mostrato una crescita significativa di organismi. Del totale (253) crescita batterica, più del novanta per cento erano batteri Gram-negativi, E. coli era il più predominante isolati tra loro. I nostri risultati sono coerenti con gli studi precedenti riportati dall’Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 New Delhi, India,36 Al-Najaf City, Iraq,37 Shashemene Referral Hospital, Ethiopia,38 e Mexico City, Mexico.39 Un tasso leggermente più elevato di infezioni batteriche Gram-negative è stato osservato tra i pazienti di sesso femminile e potrebbe essere dovuto alla maggiore prevalenza di infezioni del tratto urinario tra le donne. Questo è coerente con gli studi precedenti del Model Hospital, Kathmandu,17 e Andra-Pradesh, India.40 Coerentemente con questo studio, un tasso più alto di infezioni da pus nei casi post-operatori è stato riportato nelle femmine (63,33%) rispetto ai maschi (43,75%) da uno studio condotto nello stato di Uttar Pradesh in India.41

In questo studio, gli isolati batterici Gram-negativi hanno mostrato una maggiore resistenza ai seguenti antibiotici: cefoxitina, ceftazidime, ciprofloxacina e cefepime, seguita dal cotrimoxazolo, mentre meropenem, imipenem, piperacillina-tazobactam e azitromicina sono stati riportati come gli antibiotici più sensibili. Un modello simile è stato osservato in alcuni dei risultati precedenti dal Chitwan Medical College, Chitwan,42 Padma Hospital, Pokhara.43 La cefoxitina e la ceftazidima con bassi tassi di suscettibilità sono i farmaci di prima linea che sono facilmente idrolizzati dagli enzimi batterici e sono meno utili nel trattamento delle infezioni causate da patogeni Gram-negativi. Simile al nostro studio, imipenem/meropenem è stato trovato come il farmaco più sensibile negli studi precedenti dal Model Hospital, Kathmandu,17 Madrid Spagna,44 e Wisconsin, USA.45

La resistenza antimicrobica (AMR) con la crescente diffusione di MDR è una preoccupazione globale, e il suo impatto è maggiore nei paesi a basso e medio reddito dove il peso delle malattie infettive è alto.30 Il trattamento dei microbi MDR è costoso e difficile ed è ulteriormente aggravato dall’alta prevalenza di infezioni nosocomiali.46 In questo studio, quasi la metà degli isolati Gram-negativi isolati (46,9%; 106/226) sono risultati MDR. Una maggiore prevalenza di batteri MDR è stata riportata da alcuni altri studi condotti a Kathmandu46-49 e in altri distretti del Nepal.15,50,51 La produzione di ESBL, metallo β-lattamasi (MBL) o AmpC β-lattamasi potrebbe essere la ragione dietro la ridotta suscettibilità verso la nuova generazione di antibiotici.52 Inoltre, la resistenza multi-farmaco si verifica a causa dell’aggregazione e dell’espressione di diversi geni su plasmidi resistenti (R) o geni che codificano pompe di efflusso multi-farmaco.53 Inoltre, i geni responsabili dell’espressione degli enzimi β-lattamasi sono costantemente associati agli antibiotici non-β-lattamici come aminoglicosidi e fluorochinoloni.

In questo studio, la produzione di AmpC è stata trovata più alta tra i pazienti maschi (41,67%) rispetto alle femmine (38,98%). I risultati di questo studio sono coerenti con alcuni altri studi di Kano, Nigeria nord-occidentale.54 Tuttavia, i nostri risultati differiscono dagli studi riportati da Benin, Nigeria.55 Molti studi hanno riportato una maggiore prevalenza di UTI con resistenza a più farmaci tra le donne, questo può essere dovuto alla maggiore prevalenza di patogeni che producono AmpC tra le donne, poiché sono più inclini alle UTI rispetto agli uomini.

L’uso della resistenza alla cefoxitina nei laboratori diagnostici serve come agente/marcatore di screening affidabile per rilevare la produzione di AmpC. Inoltre, questo marcatore fornisce un buon valore predittivo negativo.

Nonostante la loro ampia portata, alcuni studi hanno sottolineato l’uso della cefoxitina come uno scarso agente di screening per la produzione di AmpC. Questo potrebbe essere dovuto all’esistenza di meccanismi alternativi all’AmpC (uno di questi è la mutazione del canale della porina) che può portare a una falsa interpretazione positiva (come resistenza alla cefoxitina).52 Il nostro studio ha rivelato che un terzo degli isolati Gram-negativi (>40%) erano responsabili della produzione di AmpC. I risultati di questo studio sono in contrasto con lo studio del Model Hospital, Kathmandu.17 La differenza può essere dovuta al metodo di rilevamento fenotipico utilizzato in questo studio che ha usato il test di resistività alla cefoxitina e il metodo del test del disco AmpC usando cefoxitina (30µg). Il test di conferma utilizzato è stato il test dell’acido fenilboronico utilizzando la cefoxitina 30µg/400µg di acido fenilboronico. I derivati dell’acido boronico si sono dimostrati come inibitori reversibili degli enzimi AmpC β-lattamasi.56

In questo studio, la produzione di AmpC è stata osservata in 91 (80,53%) isolati su 113. Il tasso di produzione di AmpC nel nostro studio è leggermente più alto di altri studi riportati dal Model Hospital, Kathmandu,17 Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 e India.59

Per compensare le limitazioni dovute a uno dei metodi, l’integrazione di entrambe le tecniche nella diagnosi di routine può aumentare la sensibilità e la specificità dei test negli ambienti clinici.

Un totale di 73 isolati Gram-negativi ha mostrato la presenza di entrambi i geni blaCITM e blaDHAM. Questi risultati sono coerenti con uno studio precedente riportato da Ilam, Iran.27 In uno studio simile riportato dall’India, ha mostrato che i geni blaCITM erano più prevalenti in E. coli.60 Nel nostro studio, la prevalenza dei geni associati ad AmpC (blaCITM e blaDHAM) è stata indagata con metodi fenotipici e genotipici. Questo studio fornisce un’ampia analisi dei batteri Gram-negativi associati alla produzione di β-lattamasi AmpC e dei loro modelli di suscettibilità agli antibiotici tra gli isolati clinici. I risultati di questo studio sono importanti per informare i modelli di resistenza di vari organismi verso le cefalosporine. La sorveglianza della resistenza multi-farmaco con β-lattamasi tra cui ESBL, MBL, e la produzione di AmpC sono necessari per una pratica clinica di routine per ottimizzare il trattamento e prevenire ulteriori resistenze tra gli antibiotici β-lattamici.13,61,62

Punti di forza e limiti

Questo è il primo studio che esplora i geni delle β-lattamasi AmpC (blaCITM e blaDHAM) utilizzando sia il test fenotipico che quello molecolare tra i pazienti che frequentano un centro sanitario terziario del Nepal. I risultati di questo studio possono informare la politica antimicrobica per i centri di cura terziari, compresa la preparazione della gestione delle infezioni ospedaliere, il protocollo di trattamento e la procedura diagnostica. Ci sono alcune limitazioni di questo studio che includono l’indagine di un numero limitato di AmpC β-lattamasi, la breve durata dello studio e l’essere condotto in un singolo centro di cura terziaria. Gli studi futuri possono basarsi su di esso per condurre uno studio longitudinale in più centri di cura terziari con l’esplorazione di tutte le β-lattamasi come ESBL, MBL, KPC e i principali geni responsabili della resistenza. Tuttavia, come primo studio del suo tipo che triangola i metodi fenotipici e molecolari, questo studio sarà un riferimento prezioso per gli studi futuri sulle β-lattamasi AmpC e la prevalenza dei geni blaCITM e blaDHAM in altri ambienti/ospedali del Nepal.

Conclusione

I nostri risultati mostrano che la ridotta suscettibilità alla cefoxitina negli isolati Gram-negativi è legata alla presenza di geni AmpC mediati da plasmidi. Poiché manca un singolo metodo definitivo, si suggerisce di utilizzare diversi metodi di rilevamento fenotipico simultaneamente per il rilevamento preciso dei batteri produttori di AmpC β-lattamasi. In questo studio, la PCR ha rilevato quasi il 90% dei geni AmpC β-lattamasi (blaCITM e blaDHAM) tra gli isolati confermati fenotipicamente. L’alta prevalenza di geni resistenti e MDR tra gli isolati Gram-negativi è un segnale allarmante, che richiede misure di intervento urgenti per frenare la crescita e la diffusione di questi isolati.