L’ingegneria dei ribosomi rivela l’importanza dell’autonomia dell’rRNA 5S per l’assemblaggio dei ribosomi

Costruzione dei plasmidi

Tutti i plasmidi sono stati costruiti mediante assemblaggio Gibson50, con i backbone dei plasmidi preparati mediante PCR inversa o digest della nucleasi di restrizione e gli inserti generati mediante PCR o sintetizzati chimicamente da Integrated DNA Technologies. I plasmidi codificanti rRNA sono stati inizialmente elettroporati in E. coli POP2136 cellule (genotipi di tutti i ceppi utilizzati in questo studio sono elencati nella tabella 1 supplementare) e trasformanti sono stati recuperati su piastre LB integrato con gli antibiotici appropriati; piastre sono state incubate a 30 ° C per impedire l’espressione dei geni rRNA controllato dal promotore lambda PL 31. Tutti gli altri plasmidi sono stati trasformati e propagati nel ceppo E. coli JM109 e cresciuto a 37 ° C in mezzi LB integrato quando necessario con 100 μg/ml di ampicillina (Amp), 50 μg/ml di kanamicina (Kan) o 50 μg/ml di spectinomicina (Spc).

Costruzione del plasmide ptRNA100

Il backbone del plasmide che include l’origine di replicazione pA15 e il gene di resistenza Spc, è stato amplificato in PCR dal plasmide ptRNA6751 usando i primer NA1 e NA2 (tutti i primer sono elencati nella tabella 4 supplementare). Il cluster di geni tRNA (che codifica tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp, e tRNAAsp), sotto il controllo del promotore Ptac e del terminatore T1, è stato sintetizzato come gBlock (Integrated DNA Technology). Il plasmide pTRNA100 è stato generato dall’assemblaggio Gibson. La struttura del plasmide è stata verificata mediante digest di restrizione e la presenza del cluster di tRNA nato nel plasmide è stata confermata mediante amplificazione PCR utilizzando i primer NA3 e NA4 e mediante sequenziamento.

Costruzione dei plasmidi pDH42, pDH39 e pCH84

I costrutti che portano il gene 23S-cp5S rRNA ibrido sono stati generati sulla base del plasmide pAM55229, che ospita l’operone E. coli rrnB rRNA. Il gene 5S rRNA è stato eliminato mediante PCR inversa utilizzando i primer NA17 e NA18, che ospitano il sito di restrizione Xho1, la digestione del prodotto PCR da parte di Xho1 e la legatura del DNA. La mutazione di resistenza Ery A2058G è stata poi introdotta nel gene 23S rRNA tramite mutagenesi sito-diretta usando il kit di mutagenesi sito-diretta QuikChange Lightning Multi (Agilent Technologies) con il primer NA7. Il plasmide risultante, pAM552Δ5S è stato utilizzato per introdurre i geni cp5S rRNA con linker in tre diverse posizioni all’interno del gene 23S rRNA.

La preparazione della sequenza di cp5S rDNA per l’integrazione nel 23S rDNA è stata effettuata in una singola reazione PCR in cui le coppie di primer NA8/NA9 (per i costrutti DH39 e DH42) o NA26 e NA27 (per il costrutto CH84) (100 nM ciascuno) che portavano l’inserto cp5S rDNA, sono stati combinati con coppie di primer (250 nM ciascuno) che introducevano linker di sequenze casuali, di dimensioni variabili da 0 a 3 nt, alle giunzioni 23S-cp5S “sinistra” e “destra”, come segue: NA10-NA13 e NA14-NA17 per il DH39; NA18-NA21 e NA22-NA25 per il DH42; NA28-NA31 e NA32-NA35 per il CH84.

Per la generazione delle librerie plasmidiche DH39, DH42, e CH84, il plasmide pAM552Δ5S è stato aperto mediante PCR inversa utilizzando le coppie di primer NA36/NA37, NA38/NA39, e NA40/NA41, rispettivamente. Gli inserti di cp5S rDNA sono stati introdotti nei backbone plasmidici amplificati dalla PCR risultante dalle reazioni di assemblaggio Gibson. I prodotti di reazione sono stati trasformati in cellule E. coli POP2136 per elettroporazione e i trasformanti sono stati recuperati su piastre di agar LB/Amp coltivate a 30 °C (condizioni che impediscono l’espressione del plasmide-borne rRNA). Ogni libreria aveva almeno 3 volte più cloni rispetto alla diversità teorica stimata di 7225 varianti. Le colonie sono state lavate dalle piastre LB, le librerie di plasmidi sono state estratte e conservate.

Sostituzione di ptRNA67 con ptRNA100

Il ceppo E. coli SQ171 che manca di alleli cromosomici rRNA e porta il plasmide pCSacB come fonte dei geni rRNAs e il plasmide ptRNA67 come fonte dei geni tRNA cromosomici mancanti32,52, è stato usato come ceppo ospite di partenza. Al fine di sostituire il plasmide ptRNA67 con ptRNA100, cellule SQ171 sono stati prima trasformati con ptRNA-Amp (fornito da Michael O’Connor, Università del Missouri, Kansas City), che assomiglia ptRNA67 ma conferisce resistenza Amp e contiene l’origine pBR322 di replicazione. I trasformanti sono stati poi curati dal plasmide ptRNA67 passando in mezzo LB integrato con Amp e Kan per ~ 100 generazioni. La perdita del plasmide ptRNA67 è stata verificata dalla sensibilità dei cloni a Spc su placcatura di replica. Il ceppo risultante è stato poi trasformato con ptRNA100 e piastrato su agar LB integrato con Spc e Kan. I trasformanti sono stati fatti passare per ~ 100 generazioni in terreni LB integrati con Spc e Kan. La perdita del plasmide ptRNA-Amp è stata verificata dalla sensibilità dei singoli cloni ad Amp come rivelato dalla placcatura di replica. La presenza di ptRNA100 e la mancanza di ptRNA67 sono state inoltre verificate tramite PCR e digest di restrizione dei plasmidi totali preparati dal clone risultante.

Inattivazione del gene recA nelle cellule SQ171/ptRNA100

Il gene recA nel ceppo SQ171/ptRNA100 è stato inattivato dalla trasduzione del fago P1. Il ceppo donatore BW25113 recA::cat è stato prima preparato con la procedura convenzionale di ricombinazione52 usando la cassetta di resistenza al cloramfenicolo (Chl) dal plasmide pKD352. La cassetta è stata amplificata in PCR usando i primer NA42 e NA43. Il frammento PCR è stato trasformato nel ceppo BW25113 che porta il plasmide pDK46 che esprime la ricombinasi rossa. Dopo la verifica dell’integrazione della cassetta del gatto e la polimerizzazione di pKD46, le cellule BW25113 recA::cat sono state utilizzate come donatori per la trasduzione fagica. P1 trasduzione fagi è stata effettuata secondo il protocollo standard53 tranne che l’incubazione di recupero è stato esteso da 1 a 3 ore prima di placcare i trasduttori su piastre LB/agar integrato con Kan, Spc e 15 μg / ml Chl. Per l’escissione della cassetta del gatto, il ceppo risultante è stato trasformato con il plasmide pZFLP-TetR che codifica l’enzima flippase e i trasformanti sono stati piastrati su piastre LB/agar integrate con Kan, Spc e 2,5 μg/ml di tetraciclina (Tet). L’eliminazione del gene del gatto è stata confermata dalla PCR e dalla sensibilità Chl dei cloni. Quindi, il plasmide pZFLP-TetR è stato eliminato facendo passare le cellule per ~100 generazioni in mezzo LB integrato con Kan, Spc, e i cloni risultanti sono stati testati per la sensibilità a Tet. Il ceppo risultante è stato chiamato SQA18 (Tabella supplementare 1).

Introduzione delle librerie 23S-cp5S in cellule SQA18

Le librerie di plasmidi estratte da cellule POP2136 sono state trasformate in cellule SQA18 mediante elettroporazione. Dopo 2 ore di recupero a 37 °C, i trasformanti sono stati piastrati su piastre di agar LB/Amp che sono state incubate per una notte a 37 °C. Le colonie sono state lavate via dalle piastre di agar e 0,01 A600 (~ 106 cellule) sono state poste in un volume di 2 ml di terreno LB integrato con 150 μg/mL Ery e 0,25% di saccarosio. Dopo una crescita di 16 ore, le cellule sono state piastrate su piastre di agar contenenti Amp, 1 mg/ml Ery e 5% di saccarosio. Le piastre sono state incubate per 48 ore a 37 °C. Colonie vitali sono apparse con le librerie DH42 e CH84, ma non con la libreria DH39. Molte delle colonie che sono apparsi sulle piastre sono stati testati da PCR colonia per la presenza di 23S-cp5S rDNA utilizzando le coppie di primer NA44/NA45 per il costrutto DH42 e primer NA46/NA47 per il costrutto CH84. L’assenza del gene 5S rRNA wt è stata verificata tramite PCR di colonia usando i primer NA48 e NA49.

Selezione dei linker 23S-cp5S rRNA preferiti

La libreria totale di plasmidi DH42 isolata dalle cellule POP2136 è stata trasformata in cellule SQA18 e piastrata su piastre LB/Amp come descritto sopra. Le colonie (~50.000) sono state lavate dalla piastra e il plasmide totale è stato estratto da ~109 cellule e usato come libreria di preselezione.

Circa 109 cellule sono state poi sottoposte alla procedura di scambio del plasmide. In particolare, sono state poste in un volume di 20 ml di terreno LB integrato con 150 μg/mL di Ery e 0,25% di saccarosio. Dopo una crescita di 4 ore, le cellule sono state piastrate su piastre di agar contenenti Amp, 1 mg/ml Ery e 5% di saccarosio. Le piastre sono state incubate per 48 ore a 37 °C. Le colonie (~50.000) sono state lavate via dalla piastra. Il plasmide totale estratto da queste cellule rappresentava la libreria post-selezione.

Il cp5S rDNA fiancheggiato da sequenze 23S rDNA e linkers è stato amplificato in PCR dalle preparazioni plasmidiche della libreria pre-selezione e post-selezione utilizzando i primer NA50 e NA51. Le librerie PCR sono state sottoposte al sequenziamento di prossima generazione.

Il fattore di arricchimento per ogni combinazione di linkers è stato calcolato utilizzando la seguente procedura. Dopo aver tagliato l’adattatore, l’intera sequenza di cp5S rRNA, ad eccezione dei 4 nucleotidi terminali su ciascuna estremità, è stata eliminata per ridurre il numero di false varianti di sequenza che apparivano a causa di errori di sequenziamento all’interno della sequenza codificante 5S. I motivi di sequenza risultanti sono stati contati nelle librerie pre- e post-selezione ed è stata calcolata la frequenza della frazione di ogni variante del linker.

Preparazione dell’RNA cellulare totale

Colture notturne dei ceppi E. coli POP2136 o SQA18 sono state coltivate a 30 °C o 37 °C, rispettivamente, in mezzo LB/Amp. Le colture sono state diluite 1:100 in 2 ml di terreno fresco e coltivate a 37 °C fino a A600 ~ 0,5. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione (5000 × g, 1 min) e risospese in 100 μl di tampone di lisi. Dopo la successiva aggiunta di 400 microlitri di tampone di estrazione (50 mM Bis-Tris pH 6.5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) e l’incubazione per 5 minuti a temperatura ambiente, RNA totale è stato estratto da fenolo / cloroformio estrazione. L’RNA è stato etanolo-precipitato, il pellet di RNA è stato lavato con 1 ml di etanolo al 70%, sciolto in acqua priva di RNasi, congelato a scatto e conservato a -80 °C.

Analisi in gradiente di saccarosio dei ribosomi e dei polisomi

Le colture di E. coli notturne sono state diluite in 50 ml di terreno LB/Amp e coltivate a A600 ~ 0,5. Chl è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 125 μg/ml e dopo 5 min di incubazione, le cellule sono state raccolte per centrifugazione (5000 × g, 10 min, 4 °C). Il pellet di cellule è stato risospeso in un tampone di lisi freddo come il ghiaccio (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml di lisozima, 0,25% di deossicolato di sodio e 2U di RQ1 RNase-free DNase I). Le cellule sono state lisate da tre cicli di congelamento-disgelo. I lisati sono stati chiariti mediante centrifugazione (20.000 × g, 15 min, 4 ° C) e 20 A260 unità di lisato sono stati caricati su 12 mL di 10-40% gradiente di saccarosio lineare in tampone 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-mercaptoetanolo. I gradienti sono stati centrifugati (3 h, 4 °C) a 39.000 rpm in un rotore SW41 (Beckman). I gradienti sono stati frazionati utilizzando un frazionatore (BioComp), registrando l’assorbanza a 254 nm. Le frazioni corrispondenti alle subunità 50S, ai ribosomi 70S e ai polisomi sono state raggruppate. RNA è stato isolato mediante estrazione fenolo / cloroformio e precipitazione etanolo.

Isolamento di ribosomi 70S e subunità ribosomiali

Per l’isolamento di ribosomi tight-couple54, colture di E. coli durante la notte sono stati diluiti in 1 L di LB / Amp medium e cresciuto a A600 ~ 0,5. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione (5.000 g, 15 min, 4 ° C), risospeso in tampone A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-mercaptoetanolo, 10 U / ml di RQ1 RNase-free DNase I), e lisato utilizzando la stampa francese a 10.000 psi. I lisati sono stati chiariti mediante centrifugazione in JA25-50 rotore (Beckman) a 13.000 rpm per 30 min a 4 ° C e surnatanti sono stati caricati su 10 ml 1,1 M saccarosio cuscino preparato in un tampone contenente 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 e 6 mM β-mercaptoetanolo, in 35 ml Quick-Seal tubi da centrifuga (Beckman). I ribosomi sono stati pellettati mediante centrifugazione per 16 ore a 36.000 rpm (4 °C) in un rotore Ti70 (Beckman). Il pellet di ribosomi è stato risospeso in tampone B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl e 6 mM β-mercaptoetanolo) e 100 unità A260 sono stati caricati su 10-40% gradiente di saccarosio preparato in tampone B nei tubi di un rotore SW27 (Beckman). I gradienti sono stati centrifugati per 21 h a 20.000 rpm (4 °C) in un rotore SW27, frazionati utilizzando il frazionatore a gradiente (BioComp) e le frazioni contenenti ribosomi 70S e subunità ribosomiali 50S sono state raggruppate separatamente. Il materiale è stato concentrato utilizzando concentratori Vivaspin da 2 ml (Sartorius) con membrana in triacetato di cellulosa e recuperato in tampone di conservazione dei ribosomi (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanolo). Aliquote di ribosomi e subunità ribosomiali sono stati flash-congelati e conservati a -80 ° C. Quando necessario, l’rRNA è stato isolato mediante estrazione con fenolo/cloroformio e precipitazione con etanolo.

Per l’isolamento delle subunità 50S dai ribosomi 70S, 130 ribosomi pmol, preparati come descritto sopra ma concentrati mediante pellettizzazione e conservati nel buffer di conservazione dei ribosomi (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanolo) sono stati diluiti nel buffer D (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NH4Cl, 0.5 mM EDTA, 6 mM β-mercaptoetanolo) per raggiungere una concentrazione finale di 1.5 mM di MgCl2. Le subunità ribosomiali sono state separate per centrifugazione in gradienti di saccarosio 10-40% preparati nel buffer D che conteneva 1,5 mM MgCl2. Gradienti sono stati centrifugati per 16 h a 27.000 rpm (4 ° C) in un rotore SW27 (Beckman), frazionato, concentrato, e recuperato nel buffer di conservazione ribosomi, come descritto sopra. Aliquote sono stati flash-congelati e conservati a -80 °C.

LC-MS/MS analisi delle proteine ribosomiali

Composizione proteica di wt e mutanti tight-couple 70S ribosomi e 50S subunità ribosomiali, preparati come descritto sopra, è stato determinato utilizzando quantitativa massa-spettrometria55. Preparati ribosomi sono stati mescolati in un rapporto molare 1:1 con SILAC-etichettato ribosomi wt contenente massa-etichettato arginina (Arg6: 6HN4O2 e lisina (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Germania). Le proteine ribosomiali sono state digerite con tripsina (Sigma) o proteasi Lys-C (Wako, USA). I peptidi risultanti sono stati frazionati e analizzati tramite LC-MS/MS utilizzando LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). Identificazione delle proteine e analisi di quantificazione sono stati eseguiti utilizzando Maxquant v1.5.6.056 e Perseus v1.6.2.357. La ricerca di Maxquant è stata effettuata utilizzando il database delle sequenze proteiche di E. coli MG1655 da UniProtKB (24.04.2019). L’abbondanza proteica è stata normalizzata per le proteine della subunità grande e piccola separatamente spostando il rapporto L/M medio a 1.

Sondaggio chimico della struttura dell’rRNA

La struttura dell’rRNA è stata sondata nei ribosomi 70S isolati da cellule wt o mutanti. I ribosomi (10 pmol) sono stati posti in 50 μl di tampone di modifica e attivati mediante incubazione per 5 minuti a 42 °C. La reazione di modifica è stata avviata con l’aggiunta di 2 μl di dimetil solfato (Sigma) diluito 1:10 in etanolo. I campioni sono stati incubati per 10 minuti a 37 °C. Le reazioni di modifica sono state fermate con l’aggiunta di 50 μl di soluzione di stop appena preparata (600 mM NaOAc, 1 M β-mercaptoetanolo) e 300 μl di etanolo. I campioni sono stati precipitati, risospesi in tampone (300 mM acetato di sodio, 5 mM EDTA, pH 8.0, pH 7.0, 0.5% SDS) e l’RNA è stato isolato mediante estrazione con fenolo/cloroformio e precipitazione con etanolo. Le estensioni dei primer sono state effettuate utilizzando i primer NA56-NA57.

Analisi del contenuto di rRNA mutante

Per l’analisi della presenza dell’rRNA 23S-cp5S ingegnerizzato, l’RNA totale è stato isolato dalle frazioni del gradiente di saccarosio come descritto sopra. Il contenuto di 23S-cp5S rRNA mutante è stato valutato mediante estensione del primer utilizzando i primer NA58 o NA59. In particolare, 5′ – primer marcato (0,5 pmol) è stato annealed a 1 μg di RNA totale in tampone di ibridazione (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) incubando a 90 ° C per 1 min e poi il raffreddamento oltre 15 min a 42 ° C, ed esteso con 2 U di AMV trascrittasi inversa (Roche) per 20 min a 42 ° C in un volume di reazione finale di 8 µl. Per il primer NA58, la reazione conteneva 0,25 mM di ddATP e 0,2 mM di dCTP, dGTP, dTTP. Per il primer NA59, la reazione conteneva 0,25 mM di ddCTP e 0,2 mM di dATP, dGTP, dTTP. Le reazioni sono state terminate aggiungendo 120 μl di stop buffer (84 mM NaOAc, 0.8 mM EDTA, pH 8.0, 70% EtOH), raffreddamento a -80 °C per 15 min, e pellettando gli acidi nucleici per centrifugazione a 15.000 × g per 1 h a 4 °C. I surnatanti sono stati rimossi, il pellet è stato asciugato e sciolto in formammide colorante di carico. I prodotti cDNA sono stati risolti in un gel di poliacrilammide denaturante al 12% e visualizzati mediante fosforimaging.

Traduzione in vitro

Le reazioni di traduzione in vitro sono state effettuate nel sistema di traduzione senza cellule Δribosome PURExpress (New England Biolabs). I template di DNA contenenti il promotore della RNA polimerasi T7, il sito di legame al ribosoma e la sequenza codificante la proteina sono stati preparati tramite PCR. Il template ermBL è stato preparato usando i primer NA52-NA55. Il template GFP è stato generato dal gene sf-gfp del plasmide pY71-sfGFP58 usando i primer NA31 e NA32. La diidrofolato reduttasi (DHFR) è stata espressa dal template plasmidico fornito con il kit PURExpress.

La reazione di traduzione per l’espressione della GFP è stata assemblata in un volume totale di 10 μl e conteneva 2 μl della soluzione A del kit PURExpress, 1.2 μl di miscela di fattori, 1 μl di miscela di aminoacidi (3 mM ciascuno), 1 μl di tRNA (20 μg/ml), 16 U di inibitore della RNasi RiboLock (ThermoFisher), 10 ng di template GFP e 12 pmol di ribosomi wt o mutanti. I campioni sono stati posti in pozzetti di un 384-pozzetti parete nera / chiaro fondo piatto tessuto-cultura piastra (BD Biosciences) e coperto con il coperchio. Le reazioni sono state incubate a 37 ° C in un lettore di micropiastre (Tecan) con fluorescenza GFP essere registrato ogni 10 min a λexc = 488 nm e λem = 520 nm per un periodo di 4 h.

Espressione di DHFR è stato seguito da incorporazione di -L-metionina nella proteina full-size. La traduzione è stata effettuata in reazioni da 10 μl assemblate come descritto sopra ma integrate con 5 μCi -L-metionina (1175 Ci/mmol), usando 50 ng del template di DNA e 6 pmol di ribosomi wt o mutanti. Le reazioni sono state incubate a 37 ° C. Ogni 12 min, aliquote 1 microlitri sono stati ritirati, mescolato con 3 microlitri di SDS contenente colorante di carico del gel e conservati in ghiaccio fino a quando il corso della reazione è stata completata. I prodotti proteici sono stati analizzati mediante elettroforesi SDS-gel in 16,5% Bis-Tris gel (Biorad) utilizzando NuPAGE MES / SD tampone di esecuzione (Invitrogen). I gel sono stati colorati, asciugati ed esposti ad uno schermo phosphorimager durante la notte. Bande radioattive sono stati visualizzati da phosphorimaging.

Cryo-EM analisi dei ribosomi 70S e 50S subunità

Cryo-EM griglie sono stati preparati come segue. Griglie di rame 400 M rivestite di carbonio pizzo e uno strato sottile di 2 nm di carbonio (Ted Pella Inc.) sono stati scaricati bagliore con 20 mA corrente con polarità negativa per 60S in un PELCO easiGlow unità di scarico bagliore. Un Mark IV Vitrobot (ThermoFisher) è stato pre-equilibrato a 4 ° C e 95% di umidità relativa. Un’aliquota di ribosomi precedentemente flash-congelato è stato scongelato e quando opalescenza è stato notato, la soluzione è stata cancellata in una centrifuga micro (10 minuti a 16.000 × g a 4 ° C). La concentrazione del surnatante ripulito è stata derivata da A260 misurata utilizzando un Nanodrop (ThermoFisher) e i ribosomi sono stati diluiti a 200 nM in LPP Buffer. Tre µl di soluzione di ribosomi 200 nM sono stati applicati alla griglia; dopo un ritardo di 10S la griglia è stata tamponata per 4S e poi immersa in etano liquido raffreddato ad azoto.

I dati sono stati raccolti su un microscopio elettronico Talos (ThermoFisher) operante a 200 KV e dotato di un rilevatore di elettroni diretti K3 (Gatan Inc.) che punta a 0,5-1,8 μm sottofondo. Raccolta dei dati è stato automatizzato con SerialEM59 utilizzando inclinazione del fascio di raccogliere più filmati (ad esempio un colpo al centro, 6 con spostamento) in ogni posizione del palco 60. Super-risoluzione film ha avuto un totale di 19 fotogrammi con 1,5 e-/Å2 per fotogramma per una dose totale di 30 e-/Å2 sul campione. Un totale di 5222 filmati sono stati raccolti oltre 22 h. I filmati sono stati allineati al volo durante la raccolta dei dati utilizzando IMOD 61 per decomprimere i fotogrammi, applicare il riferimento di guadagno, bin i dati di super-risoluzione al pixel fisico di 0,87 Å sul campione, e correggere la deriva dell’immagine.

Passi iniziali della generazione mappa 3D dalla determinazione CTF, riferimento senza particelle picking (489.732 particelle), e la creazione di stack sono stati eseguiti in cisTEM. Allineamento delle particelle e perfezionamento sono stati eseguiti in Frealign 9.11 e cisTEM62,63. Per accelerare l’elaborazione, 2 × -, 4 × -, e 8 × stack di immagini sono stati preparati utilizzando resample.exe, che fa parte della distribuzione FREALIGN 64. Il modello iniziale per l’allineamento delle particelle di mappe 70S era EMD-100365, che è stato downsampled per abbinare 8 × stack di immagini binned utilizzando EMAN 266. Due giri di ricerca in modalità 3 con un cutoff ad alta risoluzione di 30 Å poi 20 Å sono stati eseguiti utilizzando la pila 8× cestinato. Successivamente, 7 giri di affinamento in modalità 1 sono stati eseguiti con la pila 4×, alla fine unbinned come gusci di risoluzione sono stati aggiunti gradualmente (limite di 5 Å) e la risoluzione ha raggiunto 2,94 Å. Affinamento turno fascio è stato utilizzato per migliorare la risoluzione complessiva a 2,87 Å.

Venti giri di classificazione 3D a massima verosimiglianza senza mascheratura e a 14 Å risoluzione è stato utilizzato per separare rapidamente 8x particelle cestinate in 12 classi di diversa composizione rivelando 50S subunità, 70S ribosomi senza tRNA, o 70S ribosomi con tRNA e il 30S in una conformazione ruotata o non ruotata (Fig. 3a supplementare). 50S particella (133,490), particelle 70S vuoto (120,428), o tRNA-bound, non ruotato particella 70S stato (55,677) substacks sono stati creati utilizzando la pila 1x binned utilizzando merge_classes.exe, parte del pacchetto Frealign, che richiedono punteggi particella di 0 e minimo del 50% di occupazione. I substacks sono stati poi nuovamente cestinati a 4x utilizzando resample.exe per accelerare ulteriori fasi di classificazione.

Il substack di particelle 50S è stato separato in 6 classi con una maschera di fuoco di 55-Å raggio intorno alla porzione 5S rRNA dell’rRNA ibrido 23S-cp5S. Sono state separate le classi con uL16 e/o bL33 deboli o assenti e le classi che differiscono nella posizione dell’rRNA 5S. Le classi sono state ricostruite con l’allineamento originale e i parametri di inclinazione del fascio a 1x binning e una di queste classi è stata utilizzata per la modellazione strutturale come specificato nella sezione seguente.

Sono state studiate anche le particelle 70S. Il substack di particelle 70S vuoto (senza tRNA) è stato separato in 12 classi utilizzando la stessa maschera di messa a fuoco di 55-Å. Le classi hanno mostrato differenze nell’occupazione di uL16 e/o bL33 e nella posizione dell’rRNA 5S, simili alle classi 50S descritte sopra. Tuttavia, in contrasto con le particelle 50S, 3 su 12 classi 70S vuoto ha rivelato un PTC normalmente piegato.

Classificazione del classico stato tRNA-bound 70S substack di particelle in 12 classi con la stessa maschera ha rivelato l’occupazione quasi stechiometrica di 16 uL, e tutte le particelle avevano un PTC normalmente piegato e forte P-tRNA densità. Al contrario, l’occupazione del tRNA del sito A era debole in alcune classi con densità L33 più debole. La classificazione delle particelle 70S con un 30S ruotato e uno stato ibrido P/E-tRNA in 12 classi ha anche rivelato occupazioni variabili di uL16 e bL33, e sette classi presentavano PTC aberrante.

La struttura cryo-EM 3.2Å del ribosoma 70S legato con i tRNA A e P67 è stata usata come modello di partenza per il perfezionamento della struttura. I componenti/domini del ribosoma sono stati inseriti in mappe utilizzando Chimera68. Qui, il 50S, L1 gambo, L11 gambo, 30S corpo e testa, e tRNAs sono stati adattati indipendentemente. Modellazione di 5S rRNA, e le regolazioni al PTC e centro di decodifica sono stati fatti utilizzando PyMOL69. I modelli strutturali sono stati raffinati utilizzando spazio reale simulato-annealing raffinamento utilizzando RS Ref 70,71 contro le mappe corrispondenti. Parametri di raffinamento, come il peso relativo di vincoli stereochimici e termine di energia sperimentale, sono stati ottimizzati per produrre la struttura ottimale stereochimica, coefficiente di correlazione spazio reale, e R-fattore, che riporta l’adattamento del modello alla mappa 72. Vincoli struttura secondaria, che comprende vincoli di legame a idrogeno per le proteine ribosomiali e base-accoppiamento vincoli per le molecole di RNA sono stati impiegati come descritto73. Le strutture sono state raffinate utilizzando phenix.real_space_refine74 seguito da un giro di raffinamento in RSRef applicando vincoli armonici per preservare la geometria della proteina 70,71. Phenix è stato utilizzato per raffinare B-fattori dei modelli contro le loro rispettive mappe senza B-fattore di filtraggio74. I modelli strutturali risultanti hanno buoni parametri stereochimici, caratterizzati da bassa deviazione da lunghezze di legame ideale e angoli e concordano strettamente con le mappe corrispondenti come indicato da alti coefficienti di correlazione e basso spazio reale R fattori (Tabella 2 supplementare). Le figure sono state preparate in PyMOL69.

Reporting summary

Ulteriori informazioni sul progetto di ricerca sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.