La via dell’ubiquitina-proteasoma: La complessità e la miriade di funzioni della morte delle proteine

La nostra percezione della degradazione intracellulare delle proteine è cambiata radicalmente durante l’ultimo decennio. Da un processo “end point” spazzino, non regolato e aspecifico, è diventato chiaro che la proteolisi delle proteine cellulari è un processo altamente complesso, controllato temporalmente e strettamente regolato che gioca ruoli importanti in una varietà di percorsi fondamentali durante la vita e la morte cellulare. Sono state descritte due cascate proteolitiche principali. Le caspasi sono coinvolte nella morte cellulare programmata (apoptosi), mentre la degradazione della maggior parte delle proteine cellulari regolatrici a vita breve è mediata dalla via dell’ubiquitina-proteasoma. Tra queste ci sono regolatori del ciclo cellulare e della divisione come le cicline mitotiche e G1 e gli inibitori della chinasi ciclina-dipendente, regolatori della crescita come c-Fos e c-Jun, soppressori tumorali come p53, recettori di superficie come il recettore dell’ormone della crescita, e canali ionici, per esempio il regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR). Il sistema è anche coinvolto nella proteolisi selettiva delle proteine anormali/mutate e nell’elaborazione degli antigeni di classe I del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC). La scoperta che il sistema è coinvolto nella degradazione di c-myc e nell’attivazione proteolitica in due fasi di NF-κB, per esempio, ha segnalato l'”ingresso” della degradazione mediata dall’ubiquitina nell’area della regolazione trascrizionale. Attraverso la degradazione di proteine regolatrici chiave e di breve durata, il sistema sembra giocare ruoli importanti in una varietà di processi cellulari di base. Tra questi ci sono la regolazione del ciclo e della divisione cellulare, il coinvolgimento nella risposta cellulare allo stress e ai modulatori extracellulari, la morfogenesi delle reti neuronali, la modulazione dei recettori della superficie cellulare, i canali ionici e la via secretoria, la riparazione del DNA, la biogenesi degli organelli e la regolazione delle risposte immunitarie e infiammatorie. Prove recenti indicano che il sistema è coinvolto anche nell’apoptosi. Con una gamma così ampia di substrati e processi, non sorprende che aberrazioni nel processo siano state recentemente implicate nella patogenesi di diverse malattie, sia ereditarie che acquisite. Tra queste ci sono la degenerazione muscolare che segue la denervazione o l’immobilizzazione prolungata, alcune forme del morbo di Alzheimer, la sterilità maschile e la sindrome di Angelman (per recenti revisioni del sistema dell’ubiquitina, vedi i rif. 1-4).

La degradazione di una proteina attraverso la via dell’ubiquitina procede in due fasi discrete e successive: (i) attacco covalente di più molecole di ubiquitina al substrato proteico, e (ii) degradazione della proteina bersaglio da parte del complesso proteasoma 26S con il rilascio di ubiquitina libera e riutilizzabile. Per assicurare una rimozione efficiente e specifica di una certa proteina in un certo momento, sia la coniugazione dell’ubiquitina che la degradazione dei substrati marcati devono essere strettamente regolate. In uno studio pubblicato in questo numero dei Proceedings (5), Zhang e colleghi riportano l’identificazione di una regione di attivazione nella subunità α dell’attivatore del proteasoma PA28 (REG). Per inserire questa scoperta nel contesto biochimico e fisiologico appropriato, passiamo brevemente in rassegna la nostra attuale comprensione della via proteolitica dell’ubiquitina. Il sistema (raffigurato in Fig. 1) consiste di diversi componenti che agiscono di concerto. Uno di questi, l’ubiquitina, una proteina evolutivamente conservata di 76 residui, è attivata nel suo C-terminale Gly ad un intermedio tiolo-estere ad alta energia, una reazione catalizzata dall’enzima attivatore dell’ubiquitina, E1. Dopo l’attivazione, uno dei diversi enzimi E2 (proteine portatrici di ubiquitina o enzimi coniugatori di ubiquitina, UBC) trasferisce la parte di ubiquitina attivata da E1 a un membro della famiglia delle ubiquitin-protein ligasi, E3, a cui la proteina substrato è specificamente legata. E3 catalizza l’ultimo passo del processo di coniugazione, il legame covalente dell’ubiquitina al substrato. La prima unità di ubiquitina viene trasferita al gruppo ɛ-NH2 di un residuo Lys della proteina substrato per generare un legame isopeptidico. In reazioni successive, viene sintetizzata una catena di poliubiquitina mediante il trasferimento processuale di ulteriori moiety attivate al Lys48 della molecola di ubiquitina precedentemente coniugata. La catena serve, molto probabilmente, come marcatore di riconoscimento per il proteasoma (vedi sotto). L’ubiquitina K48R o l’ubiquitina metilata (in cui tutti i gruppi amminici liberi sono stati modificati chimicamente) non possono generare catene di poliubiquitina e servono come terminatori di catena. Di conseguenza, quando sono sovraespressi nelle cellule o introdotti in sistemi privi di cellule, inibiscono la proteolisi. Il legame del substrato all’E3 è specifico e implica che gli E3 svolgono un ruolo importante nel riconoscimento e nella selezione delle proteine per la coniugazione e la successiva degradazione. La struttura del sistema sembra essere gerarchica: un singolo E1 sembra effettuare l’attivazione dell’ubiquitina richiesta per tutte le modificazioni. Diverse specie principali di enzimi E2 sono state caratterizzate in cellule di mammifero. Sembra che ogni E2 possa agire con uno o più enzimi E3. Anche se finora sono stati descritti solo relativamente pochi enzimi E3, sembra che le ubiquitin ligasi appartengano a una grande famiglia di enzimi ancora in crescita. Per quanto riguarda la modalità di riconoscimento delle ligasi, tranne che in pochi casi, è improbabile che ogni E3 abbia come obiettivo un singolo substrato. Piuttosto, è concepibile che diverse proteine cellulari diverse siano riconosciute da una singola ligasi attraverso un motivo strutturale simile, ma chiaramente non identico. Alcune proteine possono essere riconosciute attraverso il loro residuo N-terminale libero e “destabilizzante” (“regola N-end”; rif. 6). Tuttavia, la stragrande maggioranza delle proteine cellulari sono acetilate ai loro termini N o hanno termini amminici “stabilizzanti” e sono bersaglio di segnali diversi. Alcuni sono riconosciuti tramite sequenze primarie che risiedono a valle del residuo N-terminale. Altri sono mirati tramite modifiche secondarie, post-traslazionali come la fosforilazione, o dopo l’associazione con proteine ausiliarie come le oncoproteine o i chaperon molecolari.

Dopo la coniugazione, la parte proteica dell’addotto viene degradata dal complesso proteasoma, e l’ubiquitina libera e riutilizzabile viene rilasciata (per recenti revisioni sui proteasomi, vedi rif. 7-10). Anche se l’attuale consenso è che il proteasoma 26S serve come principale braccio proteolitico del sistema dell’ubiquitina, lo spettro dei substrati dell’enzima può essere più ampio e includere anche proteine nonubiquitinizzate. Un caso ben studiato è quello dell’ornitina decarbossilasi (ODC). L’ODC viene degradata dopo un’associazione non covalente con un antizima che può funzionare nel processo di riconoscimento come un chaperon ubiquitin-like specifico per il substrato. Altri substrati, per lo più proteine del reticolo endoplasmatico (ER), possono anche essere degradati dal proteasoma senza precedente ubiquitinilazione, anche se questo non è stato stabilito con certezza. Queste possono includere, per esempio, le molecole della catena pesante MHC (HCs) mal ripiegate, il 3-idrossi-3-metil glutaril CoA (HMG-R) dei mammiferi, e la variante Z dell’α-1-antitripsina (α1-ATZ) (rivista in rif. 11). Inoltre, ora è chiaro che non tutte le proteine ubiquitinilate sono destinate alla degradazione da parte del proteasoma. Questo è vero soprattutto per le proteine di membrana mature della superficie cellulare, come il recettore dell’ormone della crescita. Per queste proteine, la modificazione dell’ubiquitina avviene dopo il legame con il ligando ed è necessaria per la loro endocitosi e la destinazione al lisosoma (rivista in rif. 12). La degradazione delle proteine ancorate alla membrana da parte del sistema dell’ubiquitina solleva importanti problemi meccanicistici, ancora irrisolti, che sono per lo più legati alla questione di come due eventi topologicamente distinti come il misfolding nell’ER e la degradazione nel citosol, o il legame del ligando nel dominio extracellulare e l’ubiquitinilazione sulla coda citosolica di un recettore si uniscono. Per le proteine di membrana della superficie cellulare un problema ovvio riguarda il ruolo della modifica dell’ubiquitina: è necessaria per l’endocitosi della proteina marcata o in una fase successiva, per il suo specifico targeting e l’assorbimento da parte del lisosoma. Per le proteine ER degradate dal proteasoma citosolico, le domande importanti riguardano i meccanismi che sono alla base del recupero di queste proteine attraverso la membrana nel citosol. Il dominio transmembrana delle proteine ancorate alla membrana è idrofobico e la sua rimozione dalla membrana probabilmente coinvolge un trasporto specializzato, energia-dipendente, basato su canali. Per le proteine ER lumenali, la questione è come vengono trasportate nel citosol.

Prove recenti suggeriscono che il principio della modifica dell’ubiquitina non si limita a indirizzare le proteine alla degradazione. Sembra che l’ubiquitina sia un membro di una famiglia più grande, e sono state descritte diverse proteine simili all’ubiquitina. Un caso interessante riguarda il targeting in strutture complesse. È stato scoperto che la localizzazione di RanGAP1, una proteina attivatrice di Ran GTPase, alla proteina RanBP2 del complesso del poro nucleare, dipende da una singola e stabile modifica covalente da parte di una proteina ubiquitina-simile di 11,5 kDa e 101 residui, SUMO-1 (13). La reazione di attivazione è simile a quella dell’ubiquitina e coinvolge E1 e un E2 specifico, UBC9. Quindi, la modificazione covalente post-traslazionale da parte dell’ubiquitina e delle molecole simili all’ubiquitina serve un ampio spettro di funzioni. È coinvolta nel targeting delle proteine per la degradazione da parte del proteasoma e del lisosoma, ma serve anche funzioni non proteolitiche.

Il complesso proteasoma meglio studiato coinvolto nella degradazione delle proteine legate all’ubiquitina è il complesso proteasoma 26S. Si tratta di una struttura simmetrica “a forma di conchiglia” composta da un’unità catalitica centrale, un complesso proteasomico 20S a forma di barile, che è affiancato su entrambi i lati da complessi proteasomici 19S regolatori (19S-20S-19S). La struttura cristallina del proteasoma 20S eucariotico (lievito) è stata risolta a 2,4 Å (14). Lo studio ha corroborato le previsioni precedenti sulla struttura del complesso, ma ha anche rivelato alcune caratteristiche inaspettate. Il complesso del lievito è disposto come una pila di quattro anelli, ciascuno contenente sette subunità distinte, α1-7β1-7β1-7α1-7. Le diverse subunità α e β hanno masse molecolari nell’intervallo di 25-30 kDa. I siti attivi risiedono in tre subunità β, β1, β2 e β5, ma non nelle subunità α. L’analisi topologica della localizzazione delle diverse subunità ha rivelato che per le tre distinte attività proteolitiche, la tripsina, la chimotripsina e la postglutamil peptidilidrolitica, i siti attivi sono generati da coppie adiacenti di subunità β identiche che risiedono in anelli β diversi. L’analisi dei residui del sito attivo rivela un nuovo tipo di meccanismo proteolitico. Le tre subunità β subiscono l’autocatalisi tra l’ultimo residuo Gly del pro-peptide e Thr1 della subunità matura che partecipa al processo autocatalitico e diventa una parte essenziale del sito catalitico. La risoluzione della struttura cristallina ha anche permesso una migliore comprensione della modalità d’azione dei diversi inibitori del proteasoma. Thr1 in β1, β2, e β5 lega l’inibitore meno specifico della calpina I Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). La lattacistina, un inibitore più specifico, può essere legata covalentemente a β5 dove può generare, inoltre, una serie di legami idrogeno con altre catene laterali circostanti. L’analisi mutazionale ha rivelato che le altre subunità β, in particolare β4 e β7 che risiedono adiacenti a β5 e β1, influenzano l’attività di queste subunità. β6 e β7 sono anche generate da pro-proteine attraverso un processo specifico. β3 e β4 non sono processate. A causa del loro possibile ruolo nella creazione di contatti intersubunità e nella stabilizzazione della struttura complessa, sembra che i propeptidi siano essenziali per la biogenesi e la stabilizzazione della struttura proteasomale, e l’elaborazione avviene solo dopo l’assemblaggio. La struttura del cristallo ha anche dimostrato che le catene α, sebbene cataliticamente inattive, svolgono un ruolo essenziale nella stabilizzazione della struttura a due anelli delle catene β. Devono anche avere un ruolo nel legame dei complessi 19S cap, ma la struttura dei contatti e i meccanismi di legame saranno chiariti solo quando sarà risolta la struttura cristallina del complesso 26S. La struttura cristallina ha anche rivelato una distanza di 28 Å tra i residui Thr1 delle subunità β attive adiacenti. Questa distanza determina probabilmente la lunghezza dei peptidi generati durante il processo proteolitico (residui ≈8-aa) e spiega il ruolo del proteasoma nella generazione dei peptidi antigenici presentati sulle molecole MHC di classe I. L’esistenza, tuttavia, di prodotti intermedi di lunghezza variabile suggerisce un secondo sito idrolitico a valle di Thr1 (vedi sotto).

Un importante problema, ancora irrisolto, riguarda l’entrata dei substrati proteici e l’uscita dei prodotti proteolitici dal proteasoma. Il proteasoma arcaico (Thermoplasma acidophilum) contiene due pori d’ingresso di ≈13 Å alle due estremità del cilindro circondati da segmenti definiti delle sette catene α. In un contrasto sorprendente, queste porte di entrata non esistono nel proteasoma 20S eucariotico, e l’entrata nella camera catalitica degli anelli inter-β non è possibile dalle estremità del complesso. I domini N-terminali di α1, α2, α3, α6, e α7 sporgono l’uno verso l’altro e riempiono lo spazio in diversi strati di catene laterali strettamente interagenti. Così, l’ingresso dalle estremità sarà possibile solo dopo un sostanziale riarrangiamento che può potenzialmente avvenire dopo l’associazione con il complesso 19S. Tale riarrangiamento può anche richiedere energia metabolica che può essere fornita dall’attività ATPasi di diverse subunità del complesso 19S. Il complesso del lievito mostra alcuni stretti orifizi laterali, in particolare all’interfaccia tra gli anelli α e β. Queste aperture portano direttamente ai siti attivi Thr1. Sono rivestiti di residui polari che possono potenzialmente riorganizzarsi per generare aperture di ≈10 Å attraverso le quali possono entrare substrati proteici dispiegati ed estesi.

La regolazione dell’attività del proteasoma 20S avviene a diversi livelli. Dopo la stimolazione delle cellule presentanti l’antigene con l’interferone γ, tre subunità β costitutive, 1, 2 e 5, sono sostituite da nuove e distinte subunità β, β1i (LMP2), β2i (MECL1), e β5i (LMP7). Le nuove subunità sono relativamente più efficienti nella generazione di peptidi antigenici riconosciuti dalle molecole MHC di classe I e dalle cellule T citotossiche appropriate attraverso i recettori delle cellule T. Un altro tipo di regolazione coinvolge la formazione di complessi con complessi regolatori. Il proteasoma 26S è generato dopo l’associazione ATP-dipendente del complesso 20S con due complessi 19S. I complessi 19S sono composti da almeno 18 proteine distinte con una gamma di massa molecolare di 25-110 kDa. Questo complesso serve come porta d’ingresso nel nucleo catalitico e fornisce le diverse funzioni di regolazione che sono necessarie per assicurare la degradazione selettiva dei substrati legati all’ubiquitina. Queste includono, per esempio, un sito di legame per le catene di ubiquitina, l’attività di riciclaggio dell’ubiquitina e diverse ATPasi, oltre alla capacità di stimolare le diverse attività peptidasiche del complesso 20S. Infatti, sono state identificate delle subunità che svolgono tali attività. Di particolare interesse è la subunità che lega la catena di ubiquitina che è stata descritta sia nei mammiferi (S5a) che nelle piante (MBP1). Queste subunità legano i monomeri di ubiquitina; tuttavia, le catene di poliubiquitina, e in particolare quelle che contengono più di quattro moieties, si legano con una maggiore affinità. Recentemente, il gene del lievito che codifica la catena omologa, Mcb1, è stato clonato. Sorprendentemente, i mutanti con delezione Δmcb1 non mostrano alcun difetto di crescita e degradano normalmente le proteine ubiquitinizzate, ad eccezione della proteina modello a fusione lineare ubiquitina-Pro-β-Gal. Essi mostrano, tuttavia, una leggera sensibilità allo stress, come l’esposizione ad analoghi degli aminoacidi (15). Una possibile spiegazione per questi risultati inaspettati è che le proteine ubiquitinilate sono riconosciute da un’ulteriore, ancora indefinita, subunità proteasomale. Uno di questi candidati è l’enzima deubiquitinilante Doa4 che funziona per rimuovere le società di ubiquitina dai substrati proteolitici. Una possibilità remota è che il proteasoma non riconosca le società di ubiquitina, ma che, in modo simile ai chaperon molecolari, si associ a motivi mal definiti di misfolding nel substrato proteico. Questi motivi sono generati dopo la “denaturazione” della proteina tramite il tagging dell’ubiquitina. L’identificazione della specificità di riconoscimento del proteasoma e il ruolo che l’ubiquitina gioca in questo processo sono essenziali per comprendere i meccanismi d’azione della proteasi in particolare e del sistema dell’ubiquitina in generale. Un’altra funzione di regolazione del proteasoma 19S coinvolge l’editing della catena di poliubiquitina. Il complesso contiene un’isopeptidasi di 37 kDa che rimuove singole società di ubiquitina dall’estremità distale di brevi catene di poli-ubiquitina (16). Si presume che questa isopeptidasi sia coinvolta nell’editing e nel salvataggio di proteine scarsamente ubiquitinilate o lentamente degradate dalla degradazione. È diversa in questo senso da Doa4 e da un’isopeptidasi ATP-dipendente che è associata al proteasoma. I due enzimi sono coinvolti nel riciclaggio dell’ubiquitina e nel mantenimento del livello di ubiquitina libera nella cellula.

Un altro complesso che si associa al proteasoma 20S e ne aumenta drasticamente l’attività è PA28 (REG o il regolatore 11S; rif. 17 e 18). A differenza dell’associazione con 19S, la formazione del complesso con PA28 è indipendente dall’ATP. Dopo l’associazione, PA28 aumenta la Vmax e diminuisce il Km del complesso 20S verso tutta una serie di peptidi diversi. Il complesso PA28-20S-PA28 è inattivo, tuttavia, verso le proteine intatte native o coniugate con ubiquitina. L’attivatore puro è un complesso di due subunità ≈28-kDa, PA28α e PA28β, che sono ≈50% identiche. L’immunoprecipitazione con anticorpi specifici per le subunità e gli esperimenti di reticolazione chimica hanno rivelato che PA28 è un esamero a forma di anello che è composto da subunità α e β alternate con una stechiometria di (αβ)3 (19). È interessante notare che queste subunità sono anche identiche per il 30-40% a una proteina nucleare di funzione finora sconosciuta, l’antigene Ki, che reagisce con i sieri di pazienti con la malattia autoimmune lupus eritematoso sistemico. Il complesso esamerico ha una struttura ad anello (Fig. 1) e copre il complesso proteasoma 20S su uno o entrambi gli endplates. La struttura del cappuccio è attraversata da un canale centrale con un’apertura di 20 Å all’estremità estrema e un’apertura di 30 Å sulla superficie di legame del proteasoma (20, 21). Le aperture e il canale servono, molto probabilmente, come parte del meccanismo di traslocazione dei substrati peptidici in rotta verso la camera catalitica del complesso 20S. PA28α può generare hexa- o hepta-omultimeri che si associano con il complesso 20S e lo attivano, anche se in modo meno efficiente dell’eteromultimero (αβ)3. Al contrario, PA28β non si associa con il complesso 20S e non ha alcuna attività stimolante. Il ruolo delle subunità β è probabilmente quello di modulare l’attività di PA28 influenzando indirettamente l’attività delle subunità α o modificando l’affinità della particella PA28 al proteasoma 20S.

PA28α contiene nella sua parte centrale una sequenza unica, il motivo KEKE che è un dominio idrofilo composto dall’alternanza di residui Lys caricati positivamente e residui Glu caricati negativamente. È stato postulato che questo motivo, che non esiste in PA28β, promuove l’interazione proteina-proteina tra le subunità α della particella PA28 e le subunità α del proteasoma 20S (22). L’analisi mutazionale ha rivelato, tuttavia, che ΔKEKE PA28α mantiene la sua attività stimolatoria (23). Il legame al proteasoma 20S, tuttavia, richiede una terminazione C intatta di PA28α e può coinvolgere la subunità C2 α del proteasoma 20S (8). È stato suggerito che la fosforilazione attivi l’attività stimolatoria di PA28α, tuttavia, questa modalità di regolazione non è stata stabilita con certezza.

L’analisi mutazionale di PA28α da parte di Zhang e colleghi (5) ha rivelato diverse mutazioni inattivanti in un ciclo definito alla base della molecola. Alcune delle proteine mutanti si legano strettamente al complesso 20S, ma non possono attivarlo (5). Così, il legame al proteasoma può essere chiaramente separato dall’attività stimolatoria di PA28. È interessante notare che c’è un grande divario nella distribuzione delle mutazioni inattivanti che abbracciano i residui aminoacidici 51-122. Questa zona senza mutazioni rappresenta una regione che è unica per ogni subunità del complesso PA28. Probabilmente non è coinvolta nell’interazione di PA28 con il complesso 20S o nello stimolare la sua attività proteolitica. Piuttosto può avere un ruolo nella funzione della particella nella cellula intatta, come nella sua localizzazione intracellulare o nell’associazione con altri componenti che determinano la sua attività specifica e le sue interazioni.

Un problema importante riguarda i ruoli fisiologici di PA28. Entrambe le subunità sono marcatamente indotte dall’interferone γ, suggerendo un ruolo della particella nella funzione di elaborazione dell’antigene del proteasoma. La sovraespressione di PA28α in una linea di fibroblasti di topo che esprime la proteina pp89 del citomegalovirus risulta in un marcato miglioramento del riconoscimento da parte delle cellule T citotossiche pp89-specifiche. Allo stesso modo, anche la presentazione di una nucleoproteina dell’influenza è stata migliorata (24). Gli studi in un sistema privo di cellule hanno rivelato che usando un meccanismo coordinato di doppio clivaggio, il complesso PA28-20S-PA28, può efficacemente tagliare grandi peptidi (che hanno sequenze di accompagnamento su entrambi i termini N e C) ai precisi epitopi antigenici riconosciuti dal complesso MHC e dalle cellule T citotossiche appropriate (25). Quindi, sembra che PA28 svolga un ruolo importante nell’elaborazione degli antigeni per la presentazione sulle molecole MHC di classe I. Poiché il proteasoma PA28-20S-PA28 non può digerire proteine intatte native o ubiquitinilate, deve agire a valle del proteasoma 19S-20S-19S che degrada le proteine legate all’ubiquitina o i grandi peptidi. È anche possibile, sebbene non sia stato dimostrato, che esista un singolo proteasoma asimmetrico 19S-20S-PA28 che può effettuare questo processo proteolitico in due fasi, proteolisi iniziale a grandi peptidi e rifinitura finale. I proteasomi simmetrici o putativi asimmetrici contenenti PA28 possono anche essere coinvolti nella degradazione terminale dei peptidi in aminoacidi liberi, un’attività che non può essere catalizzata dal proteasoma 19S-20S-19S (Fig. 1). Così, sembra che l’elucidazione dei ruoli cellulari del complesso PA28 dovrà attendere ulteriori esperimenti.