Isoenzima fosfatasi alcalina

Struttura genomica, chimica delle proteine ed enzimologia della fosfatasi alcalina

ALP (ortofosforico-monoestere fosfoidrolasi, ottimo alcalino, EC 3.1.3.1) si trova in tutta la natura in piante e animali (McComb et al., 1979). Negli esseri umani, quattro isoenzimi ALP sono codificati da quattro geni separati (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Tre degli isoenzimi hanno un’espressione essenzialmente tessuto-specifica e sono designati come ALP intestinale, placentare e germinale (placentare). Il quarto isoenzima dell’ALP è espresso in modo ubiquitario e pertanto è denominato TNSALP (Stigbrand e Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). I tessuti scheletrico, epatico e renale sono particolarmente ricchi di TNSALP. Le proprietà fisico-chimiche distintive (stabilità al calore, mobilità elettroforetica, ecc.) tra le ALP purificate da ossa, fegato e reni umani si perdono con l’esposizione alle glicosidasi (Moss e Whitaker, 1985), e TNSALP è quindi una famiglia di isoenzimi “secondari” (li chiamerò “isoforme”). Sono codificati dallo stesso gene, hanno la stessa sequenza polipeptidica e differiscono solo per le modifiche post-traslazionali che coinvolgono i carboidrati (Harris, 1980).

Il simbolo di mappatura del gene per TNSALP è ALPL (“ALP-liver”), anche se la funzione dell’isoforma epatica di TNSALP non è nota (vedi dopo). ALPL si trova vicino alla punta del braccio corto del cromosoma 1 (1p36.1-p34), mentre i geni per le ALP intestinali, placentari e germinali sono sulla punta del braccio lungo del cromosoma 2 (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL sembra rappresentare il gene ancestrale, mentre le ALP tessuto-specifiche si sono probabilmente formate per duplicazione genica (Harris, 1990). ALPL è un po’ più grande di 50 kb e contiene 12 esoni, 11 dei quali sono tradotti per formare l’enzima maturo che consiste di 507 residui di aminoacidi (Weiss et al., 1988b). Le sequenze TATA e Sp1 possono essere elementi regolatori, ma l’espressione basale sembra riflettere effetti promotori “housekeeping”, mentre l’espressione differenziale in vari tessuti può essere mediata da un meccanismo post-trascrizionale (Kiledjian e Kadesch, 1990). ALPL ha due promotori e due corrispondenti esoni 5′ non codificanti, 1a e 1b. La loro espressione si traduce in due diversi mRNA con differenti regioni 5′ non tradotte (Nosjean et al., 1997). La trascrizione avviene preferenzialmente dal promotore a monte (1a) negli osteoblasti e dal promotore a valle (1b) nel fegato e nel rene (Millán, 2006).

I geni ALP tessuto-specifici sono più piccoli di ALPL, principalmente a causa di introni più brevi. Le sequenze di amminoacidi dedotte dai loro cDNA suggeriscono un’identità posizionale dell’87% tra le ALP placentari e intestinali, ma solo il 50%-60% di identità tra le ALP tessuto-specifiche e TNSALP (Harris, 1990).

La sequenza di residui di amminoacidi di TNSALP indica cinque potenziali siti di glicosilazione N-linked (Weiss et al., 1988). La N-glicosilazione è necessaria per l’attività catalitica. La O-glicosilazione caratterizza l’isoforma ossea, ma non quella epatica (Nosjean et al., 1997).

Nel 2000, la struttura cristallina dell’ALP placentare umana è stata delineata con una risoluzione di 1,8-Å (Le Due et al., 2000). Il sito attivo di TNSALP deriverebbe da una sequenza nucleotidica conservata nelle ALP in tutta la natura (Henthorn e Whyte, 1992), riflette sei esoni e comprende 15 residui aminoacidici (Zurutuza et al., 1999).

Le ALP sono Zn++-metalloenzimi (McComb et al., 1979). L’attività catalitica richiede una configurazione multimerica di subunità identiche con ogni monomero che ha un sito attivo e due atomi di Zn++ che stabilizzano la struttura terziaria (Kim e Wycoff, 1991).

Le ALP sono generalmente considerate omodimere in circolazione (McComb et al., 1979). TNSALP, nella sua forma dimerica simmetrica, ha una topologia αβ per ogni subunità che include un foglio β a dieci filamenti al suo centro (Hoylaerts e Millán, 1991). Tuttavia, nei tessuti, le ALP sono legate (vedi più avanti) alle superfici cellulari, forse come omotetrameri (Fedde et al., 1988).

In vitro, le ALP hanno ampie specificità di substrato e pH optima che dipendono dal tipo e dalla concentrazione di fosfocomposto in fase di catalisi (McComb et al., 1979). L’attività catalitica richiede Mg++ come cofattore (McComb et al., 1979). I PPi così come i fosfoesteri possono essere idrolizzati (Xu et al., 1991). La reazione coinvolge la fosforilazione-defosforilazione di un residuo di serina. La dissociazione del Pi legato covalentemente sembra essere il passo limitante. Infatti, il Pi è un potente inibitore competitivo dell’ALP (McComb et al., 1979; Kim e Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Tuttavia, può anche essere che il Pi stabilizzi l’enzima (Farley, 1991).

Sussistono incertezze sulla biosintesi dell’ALP negli organismi superiori. Le sequenze geniche degli isoenzimi ALP umani indicano che i polipeptidi nascenti hanno una breve sequenza di segnale di 17-21 residui aminoacidici (Harris, 1990) e un dominio idrofobico al loro terminale carbossilico (Weiss et al., 1988b). La degradazione intracellulare delle ALP può coinvolgere i proteasomi (Cai et al., 1998). Tuttavia, queste ALP si legano alla superficie esterna delle membrane plasmatiche legate al gruppo di testa polare di un gruppo fosfatidilinositolo-glicano (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994) e possono essere rilasciate dalla fosfolipasi specifica per il fosfatidilinositolo (Fedde et al., 1988). Tuttavia, la loro precisa interazione con il fosfatidilinositolo può differire tra gli isoenzimi dell’ALP (Seetharam et al., 1987).

L’ALP senza lipidi è la frazione normalmente presente in circolazione. Tuttavia, i meccanismi di rilascio dell’ALP dalle superfici cellulari non sono noti. Il processo potrebbe coinvolgere una fosfatidasi di tipo C o D, azione detergente, proteolisi, frazionamento della membrana o lipolisi (Alpers et al., 1990).

In uomini e donne sani, quasi tutta l’attività ALP nel siero o nel plasma deriva da quantità approssimativamente uguali delle isoforme ossee ed epatiche della TNSALP (Millán et al., 1980). I neonati e i bambini, in particolare i neonati e gli adolescenti, hanno livelli più alti nel sangue dell’isoforma ossea (McComb et al., 1979). Alcuni individui con gruppo sanguigno B e O che sono “secretori” aumentano la piccola quantità di ALP intestinale in circolazione dopo aver ingerito un pasto grasso (Langman et al., 1966; McComb et al., 1979). In genere, tuttavia, l’ALP intestinale contribuisce solo per pochi punti percentuali all’attività ALP totale del siero (massimo 20%) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). L’ALP placentare è solitamente espressa e circola solo durante l’ultimo trimestre di gravidanza (Birkett et al., 1966). Diversi tumori, tuttavia, rilasciano ALP placentare o delle cellule germinali (“placental-like”) nel sangue (Millán, 1988). L’eliminazione dell’ALP circolante, come per molte altre glicoproteine, comporta probabilmente l’assorbimento e la degradazione da parte del fegato (Young et al., 1984).