ISH: protocollo di ibridazione in situ

Conservazione dei campioni

Conservazione dell’RNA
La conservazione dell’RNA è resa difficile dalla presenza dell’enzima RNasi. Questo enzima si trova sulla vetreria, nei reagenti e sugli operatori e i loro vestiti. La RNasi distrugge rapidamente qualsiasi RNA nella cellula o la sonda RNA stessa, quindi gli utenti devono assicurarsi di utilizzare tecniche, guanti e soluzioni sterili per evitare la contaminazione da RNasi della sonda o dell’RNA del tessuto.

Conservazione generale dei campioni quando si utilizzano sezioni congelate
Per ottenere i migliori risultati sui vetrini più vecchi, non conservare i vetrini a secco a temperatura ambiente. Invece, conservare in etanolo al 100% a -20°C, o in una scatola di plastica coperta da pellicola trasparente a -20°C o -80°C. Tale conservazione preserva i vetrini per diversi anni.

Scelta della sonda

Sonde di RNA

Le sonde di RNA dovrebbero essere lunghe 250-1.500 basi; le sonde di circa 800 basi mostrano la massima sensibilità e specificità. I modelli di trascrizione dovrebbero consentire la trascrizione di entrambi gli RNA della sonda (filamento antisenso) e del controllo negativo (filamento senso). Clonare in un vettore con promotori opponibili per ottenere questo risultato. I template circolari devono essere linearizzati prima di creare una sonda, anche se possono essere utilizzati anche template PCR.

Sonde di DNA

Le sonde di DNA forniscono un’alta sensibilità per l’ibridazione in situ. Non si ibridano così fortemente alle molecole di mRNA target rispetto alle sonde di RNA, quindi la formaldeide non dovrebbe essere usata nei lavaggi post ibridazione.

La specificità della sonda è importante. Se l’esatta sequenza nucleotidica dell’mRNA o del DNA nella cellula è nota, è possibile progettare una sonda complementare precisa. Se >5% delle coppie di basi non sono complementari, la sonda si ibriderà solo vagamente alla sequenza bersaglio. Questo significa che è più probabile che la sonda venga lavata via durante le fasi di lavaggio e di rilevamento e potrebbe non essere rilevata correttamente.

Protocollo di ibridazione in situ con sonde di RNA marcate con digossigenina (DIG)

Questo protocollo descrive l’uso di sonde di RNA a singolo filamento marcate con DIG per rilevare l’espressione del gene di interesse in sezioni fissate in paraffina.

1) Deparaffinizzazione

Per sezioni congelate, iniziare dal punto 2. Se si usano sezioni fissate in formaldeide con paraffina, continuare con questo passo.

Prima di procedere, i vetrini devono essere deparaffinati e reidratati. La rimozione incompleta della paraffina può causare una scarsa colorazione della sezione.

Porre i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti lavaggi:

• Xilene: 2×3 min
• Xilene 1:1 con 100% etanolo: 3 min
• 100% etanolo: 2×3 min
• 95% etanolo: 3 min
• 70% etanolo: 3 min
• 50% etanolo: 3 min
• Risciacquare con acqua di rubinetto fredda

Mantenere i vetrini in acqua di rubinetto fino al recupero dell’antigene. Da questo punto in poi i vetrini non possono asciugarsi perché ciò causerebbe un legame non specifico dell’anticorpo e un’elevata colorazione di fondo.

2) Recupero dell’antigene

Digerire con 20 µg/mL di proteinasi K in Tris 50 mM preriscaldata per 10-20 min a 37°C. Il tempo di incubazione e la concentrazione della proteinasi K possono richiedere un’ottimizzazione.

Si consiglia di provare un esperimento di titolazione della proteinasi K per determinare le condizioni ottimali. Una digestione insufficiente ridurrà il segnale di ibridazione e una digestione eccessiva provocherà una scarsa morfologia del tessuto, rendendo la localizzazione del segnale di ibridazione molto difficile. La concentrazione ottimale della proteinasi K varia a seconda del tipo di tessuto, della durata della fissazione e delle dimensioni del tessuto.

3) Sciacquare i vetrini 5 volte in acqua distillata.
4) Immergere i vetrini in acido acetico ghiacciato al 20% (v/v) per 20 secondi. Questo permeabilizza le cellule per permettere l’accesso alla sonda e all’anticorpo.
5) Disidratare i vetrini lavandoli per circa 1 minuto per lavaggio in etanolo al 70%, etanolo al 95% ed etanolo al 100%, poi asciugarli all’aria.
6) Aggiungere 100 µL di soluzione di ibridazione ad ogni vetrino.

Soluzione di sale (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7.5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Soluzione di Denardt (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polivinilpirrolidina)
• 10 g sieroalbumina bovina (BSA)
• 500 mL di dH2O sterile

7) Incubare i vetrini per 1 ora in una camera di ibridazione umidificata alla temperatura di ibridazione desiderata. Le temperature di ibridazione tipiche sono comprese tra 55-62°C.
8) Diluire le sonde nella soluzione di ibridazione in provette PCR. Riscaldare a 95°C per 2 minuti in un blocco PCR per denaturare la sonda RNA o DNA. Raffreddare immediatamente su ghiaccio per evitare la riannodatura.
9) Drenare la soluzione di ibridazione. Aggiungere 50-100 μL di sonda diluita per sezione, coprendo l’intero campione. Incubare nella camera di ibridazione umidificata a 65°C per una notte. Coprire il campione con un vetrino per evitare l’evaporazione.

Durante questa fase, la sonda RNA si ibrida al corrispondente mRNA, o la sonda DNA si ibrida al corrispondente DNA cellulare. Ottimizzare la temperatura di ibridazione a seconda della sequenza della sonda utilizzata, così come il tipo di cellula o tessuto. Questa temperatura dovrebbe essere ottimizzata per ogni tipo di tessuto analizzato.

La temperatura di ibridazione ottimale per le sonde dipende dalla percentuale di basi presenti nella sequenza target. La concentrazione di citosina e guanina nella sequenza sono fattori importanti.

10) Lavaggi rigorosi

I parametri della soluzione come la temperatura, il sale e la concentrazione del detergente possono essere manipolati per rimuovere le interazioni non specifiche.

Per preparare 1 L di citrato di sodio salino 20x (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g di citrato di sodio
• 800 mL di dH2O sterile
• Regolare a pH 5 usando acido citrico, riempire a 1 L e autoclave

Lavare 1

• 50% di formamide in 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Lavare via l’eccesso di sonda e il buffer di ibridazione con temperature più alte (fino a 65°C) per brevi periodi di tempo. Se lasciato troppo a lungo questo può lavare via troppa parte della sonda ibridata RNA/DNA.

Lavaggio 2

• 0.1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Questo passaggio rimuove l’ibridazione non specifica e/o ripetitiva di DNA/RNA.

Seguire queste linee guida per ottimizzare la temperatura e la concentrazione di sale per i lavaggi di stringenza:

• Per sonde DNA/RNA molto corte (0.5-3 kb) o sonde molto complesse, la temperatura di lavaggio dovrebbe essere più bassa (fino a 45°C) e la stringenza più bassa (1-2x SSC).
• Per sonde a singolo locus o di grandi dimensioni, la temperatura dovrebbe essere intorno ai 65°C e la stringenza alta (sotto 0.5x SSC).
• La temperatura e la stringenza dovrebbero essere più alte per le sonde ripetitive (come quelle dei satelliti alfa).

11) Lavare due volte in MABT (tampone acido maleico contenente Tween 20) per 30 minuti a temperatura ambiente. Il MABT è più delicato del PBS ed è più adatto per il rilevamento dell’acido nucleico.

Per preparare 5x stock MABT

• 58 g di acido maleico
• 43,5 g di NaCl
• 55 g di Tween-20
• 900 mL di acqua

Portare il pH a 7,5 aggiungendo la base Tris. Saranno necessari circa 100 g. Portare il volume finale a 1 L.

12) Asciugare i vetrini.
13) Trasferire in una camera umidificata e aggiungere 200 µL di tampone di blocco ad ogni sezione (MABT + 2% BSA, latte o siero). Bloccare per 1-2 ore a temperatura ambiente.
14) Drenare il tampone di bloccaggio. Aggiungere l’anticorpo anti-etichetta alla diluizione richiesta nel tampone di bloccaggio. Controllare la scheda tecnica dell’anticorpo per la concentrazione/diluizione raccomandata. Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente.
15) Lavare i vetrini 5×10 min con MABT a temperatura ambiente.
16) Lavare i vetrini 2×10 min ciascuno a temperatura ambiente con tampone di precolorazione (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) Per il rilevamento della fluorescenza, procedere al punto 18. Per altre forme di rilevamento, riportare i vetrini nella camera umidificata e seguire le istruzioni del produttore per lo sviluppo del colore.

18) Sciacquare i vetrini in acqua distillata.
19) Asciugare i vetrini all’aria per 30 minuti. Lavare in etanolo al 100% e asciugare bene all’aria.
20) Montare usando la soluzione di montaggio DePeX.