Il carico di spazi perivascolari dilatati, un marker emergente della malattia dei piccoli vasi cerebrali, è altamente ereditabile

Introduzione

Gli spazi perivascolari (PVS), chiamati anche spazi di Virchow-Robin, sono normali strutture fisiologiche riempite di liquido cerebrospinale simile al segnale della risonanza magnetica e rivestite da cellule piali, che circondano la parete di arterie, arteriole, vene e venule quando penetrano nel parenchima cerebrale. I PVS appartengono al sistema glinfatico e sono coinvolti nell’eliminazione dei rifiuti, nella fornitura di substrati energetici e nella regolazione del flusso sanguigno.1,2 In determinate circostanze, come l’aumento dell’età e la malattia dei piccoli vasi cerebrali (cSVD), i PVS possono dilatarsi (spazio perivascolare dilatato) e diventare rilevabili alla risonanza magnetica cerebrale.3-7 I meccanismi alla base di questa dilatazione, che potrebbero riflettere una ridotta eliminazione glinfatica, sono speculativi.1 È stato dimostrato che i dPVS sono fortemente correlati con altri marcatori MRI di cSVD, come il volume di iperintensità della materia bianca (WMHV), gli infarti cerebrali lacunari (LIs) e i microbleed cerebrali.3-6,8 Abbiamo precedentemente dimostrato che alti gradi di dPVS nei gangli della base (BG) o nella materia bianca (WM) sono associati ad un aumentato rischio di demenza incidente, indipendentemente da altri marcatori MRI di cSVD, in persone anziane della comunità.9

I determinanti della dPVS sono poco conosciuti. I principali fattori di rischio noti sono l’età e l’ipertensione, quest’ultima più fortemente associata con dPVS in BG. Identificare i determinanti genetici di dPVS può fornire indizi importanti sui meccanismi molecolari sottostanti e sulla fisiopatologia di cSVD e demenza. Abbiamo cercato di esaminare il contributo genetico al carico dPVS misurando la loro ereditabilità e l’ereditabilità condivisa con altri marcatori MRI di cSVD nella popolazione basata su Three City (3C) Dijon Study.

Metodi

I dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili dall’autore corrispondente su richiesta ragionevole.

Popolazione dello studio

Lo studio 3C-Dijon è uno studio di coorte basato sulla comunità che comprende 4931 partecipanti non istituzionalizzati di età ≥65 anni selezionati a caso dalle liste elettorali della città di Digione tra il 1999 e il 2001.10 I partecipanti di età <80 anni e arruolati tra giugno 1999 e settembre 2000 (n=2763) sono stati invitati a sottoporsi a una risonanza magnetica del cervello. Anche se 2285 partecipanti (82,7%) hanno accettato di partecipare a causa di limitazioni finanziarie, le scansioni MRI sono state eseguite solo in 1924 partecipanti. Tra questi, 1683 erano stati anche sottoposti a genotipizzazione genome-wide. Dopo l’esclusione degli individui con tumori cerebrali (n=8), ictus (n=71), o demenza (n=7) al basale, il campione rimanente comprendeva 1597 partecipanti. La valutazione visiva e la quantificazione erano disponibili in 1559 partecipanti per dPVS e 1562 partecipanti per LI (35 individui con infarti cerebrali non lacunari sono stati esclusi); e 1495 partecipanti avevano misure WMHV quantitative automatizzate. Il protocollo dello studio è stato approvato dal comitato etico dell’ospedale universitario di Kremlin-Bicêtre. Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto.

Genotipizzazione

I campioni di DNA dei partecipanti 3C-Dijon sono stati genotipizzati con Illumina Human610Iquad BeadChips presso il Centre National de Génotypage, Evry, Francia.

La genotipizzazione è stata eseguita su 4263 partecipanti, di cui 186 sono stati esclusi dopo il controllo di qualità (metodi nel supplemento dati online-only), lasciando un totale di 4077 partecipanti. Le prime 20 componenti principali (PC) per il campione 3C-Dijon sono state generate utilizzando EIGENSOFT e utilizzate per correggere la stratificazione dell’ascendenza della popolazione (Metodi nel supplemento dati online-only). I genotipi sono stati imputati al pannello di riferimento 1000 Genomes phase I versione 3 (tutte le etnie) utilizzando MaCH 1.0, dopo aver applicato le procedure standard di controllo della qualità (Methods nel supplemento dati online-only). In totale, 11 572 501 polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) erano disponibili per l’analisi dopo il controllo di qualità.

Acquisizione RM

Valutazione delle dPVS

dPVS sono state valutate da un lettore esperto (Y.-C.Z.) e quantificate su una scala semiquantitativa. Sono state definite come lesioni di segnale simili al liquido cerebrospinale (ipointense in T1 e iperintense in T2) di forma rotonda, ovoidale o lineare con un diametro massimo <3 mm, con contorni lisci e delineati, e situate in aree fornite da arterie perforanti. Le lesioni che soddisfano gli stessi criteri ad eccezione di un diametro ≥3 mm sono state attentamente esaminate nei 3 piani (forma, intensità del segnale) per differenziarle da LI e iperintensità della materia bianca (WMH). Solo le lesioni con una tipica forma vascolare e quelle che seguivano l’orientamento dei vasi perforanti sono state considerate dPVS.3 In BG e WM, che sono le sedi con la più alta densità di dPVS, la fetta contenente il maggior numero di dPVS è stata utilizzata per la valutazione.3

Nella BG, le dPVS sono state valutate usando un punteggio di 4 gradi: grado 1 per <5 dPVS, grado 2 per 5-10 dPVS, grado 3 per >10 dPVS ma ancora numerabili, e grado 4 per innumerevoli dPVS con conseguente cambiamento cribroso nella BG (Figura). Nel WM, dPVS sono stati valutati anche utilizzando un punteggio di 4 gradi: grado 1 per <10 dPVS nel totale WM, grado 2 per >10 dPVS nel totale WM e <10 nella fetta contenente il maggior numero di dPVS, grado 3 per 10 a 20 dPVS nella fetta contenente il maggior numero di dPVS, e grado 4 per >20 dPVS nella fetta contenente il maggior numero di dPVS (Figura).3 Nell’ippocampo e nel tronco cerebrale, dPVS sono stati dicotomizzati come presenza di ≥ 1 dPVS contro nessuno. Una variabile di carico globale dPVS è stata costruita sommando i gradi dPVS in BG e WM e aggiungendo 1 punto per la presenza di ≥ 1 dPVS nell’ippocampo e 1 punto per la presenza di ≥ 1 dPVS nel tronco cerebrale. A causa del piccolo numero di partecipanti nelle categorie più alte, queste sono state combinate (punteggio globale ≥8). La variabile globale era normalmente distribuita all’ispezione visiva (Metodi nel supplemento dati online-only).

Altre misurazioni MRI

Per localizzare e misurare la WMHV è stata utilizzata una procedura automatizzata e validata.11 Sono stati definiti due sottogruppi di WMH: WMH periventricolare (pvWMH) quando la distanza dal sistema ventricolare era <10 mm e WMH profonda altrimenti. Le LI sono state valutate visivamente dallo stesso rater (Y.-C.Z.) come dPVS e sono state definite come lesioni focali con le stesse caratteristiche di segnale del liquido cerebrospinale su tutte le sequenze e con un diametro da 3 a 15 mm.3 Sono state differenziate da dPVS come descritto sopra. I volumi di materia grigia, WM e liquido cerebrospinale sono stati stimati utilizzando la morfometria basata su voxel; volume intracranico (ICV) è stato calcolato sommando questi 3 volumi.12

Analisi statistica

Il carico globale dPVS è stato analizzato come una variabile continua, data la sua distribuzione normale, mentre i sottotipi dPVS (WM e BG) sono stati studiati come variabili dicotomizzate (grado 3-4 rispetto al grado 1-2). Poiché WMHV aveva una distribuzione asimmetrica, abbiamo usato valori trasformati in log naturale (Ln), come nelle analisi precedenti.13,14 La correlazione fenotipica tra i marcatori MRI di cSVD è stata calcolata sulla base della correlazione di Spearman utilizzando il software SAS, versione 9.3 (SAS Institute, Inc, Cary, NC).

Per stimare l’ereditabilità per dPVS, WMHV, e LI, abbiamo usato l’analisi genome-wide complex trait (GCTA v1.26.0). Questo corrisponde a stimare la proporzione della varianza fenotipica dei marcatori di risonanza magnetica di cSVD spiegata da tutti gli SNPs comuni disponibili a livello di genoma, utilizzando un’analisi con modello misto lineare (Metodi nel supplemento dati online-only).15 Abbiamo poi valutato la proporzione di ereditabilità condivisa tra il carico dPVS e WMHV utilizzando le relazioni genomiche derivate da SNP e la massima verosimiglianza limitata basata sulla parentela genomica (metodo GREML bivariata).16 Utilizzando questo metodo, implementato nel software di analisi del tratto complesso genome-wide, abbiamo potuto stimare la correlazione genetica tra il carico dPVS e WMHV (complessivo e per sottotipi principali, metodi nel supplemento dati online-only). La stima della correlazione genetica con LI non è stata possibile (i modelli non convergono o producono valori aberranti). Tutte le analisi per l’ereditabilità e l’ereditabilità condivisa sono state eseguite su individui non imparentati, dopo aver rimosso a caso 1 individuo di ogni coppia con parentela stimata >0,125 (matrice di parentela genetica >0,125). Le analisi del carico dPVS e WMHV sono state aggiustate per ICV, per tenere conto delle differenze nelle dimensioni della testa, età, sesso e 20 PC, come raccomandato dal software.15

Abbiamo testato l’associazione di un punteggio di rischio genetico che combina varianti genetiche di rischio indipendenti note per la WMHV (rs7214628, rs7894407, rs78857879, rs2984613, e rs11679640)14 con il carico di dPVS usando la regressione lineare (dPVS globale) o la regressione logistica (dPVS in WM e in BG), regolando per età, sesso, le prime 4 PC, e ICV. Il punteggio di rischio genetico è stato costruito sommando il numero di alleli di rischio WMHV attraverso tutti i loci di rischio WMHV indipendenti (r2<0,010 tra SNPs). Questo punteggio non è stato ponderato perché lo studio di associazione genome-wide WMHV da cui sono stati derivati i loci di rischio è stato eseguito utilizzando la meta-analisi basata sul punteggio z, che non produce alcuna stima degli effetti.

Risultati

Popolazione dello studio

Correlazioni fenotipiche

C’era una correlazione fenotipica limitata ma significativa (ρ=0.23; P<0.0001) tra dPVS in BG e dPVS in WM-i 2 sottotipi principali di dPVS. Le correlazioni fenotipiche tra dPVS e altri marcatori MRI di cSVD sono rappresentate nella tabella 2: tutti i marcatori hanno mostrato un certo grado di correlazione a P<0.01 (ρ compreso tra 0.08 e 0.33). Il più alto coefficiente di correlazione fenotipica (ρ=0,33; P<0,0001) è stato osservato tra dPVS in BG e WMHV totale o pvWMHV. La correlazione tra dPVS (globale) e LI era più bassa, a 0,18 (P<0,0001; Tabella 2).

Analisi di ereditabilità di dPVS e altri marcatori MRI di cSVD

L’ereditabilità aggiustata per età, sesso, ICV, e 20 PC per dPVS (globale) era stimata al 59% (P=0.007) ed era più alta e significativa nel WM, stimata al 79% (P=0,042), rispetto al BG (Tabella 3). L’ereditabilità per la presenza di dPVS nell’ippocampo e nel tronco cerebrale era bassa (<4%) e non significativa. In un’analisi secondaria, prendendo il quartile superiore del conteggio dei dPVS nell’ippocampo e nel tronco cerebrale invece della presenza rispetto all’assenza, l’ereditabilità per i dPVS nell’ippocampo è risultata maggiore ma ancora non significativa (Tabella II nel supplemento dati online). Comparativamente, l’ereditabilità aggiustata per età, sesso, ICV e 20 PC per WMHV è stata valutata al 54% (P=0,010) e significativa per pvWMHV e WMHV profonda, mentre l’ereditabilità aggiustata per età, sesso e 20 PC per LI era inferiore e non significativa (48%; P=0,278; Tabella 3). Da notare, le stime di ereditabilità di dPVS e altri marcatori MRI di cSVD erano sostanzialmente invariate dopo l’aggiustamento per l’ipertensione e il diabete mellito, i 2 principali fattori di rischio noti per cSVD (Tabelle III e IV nel supplemento dati online).

Ereditabilità condivisa di dPVS con altri marcatori MRI di cSVD

Associazione di varianti di rischio note per WMHV con carico dPVS

Abbiamo trovato un’associazione nominalmente significativa di un punteggio di rischio genetico che combina tutte le varianti di rischio WMHV indipendenti pubblicate con dPVS in BG (P=0.031), con gli alleli di rischio WMHV in aggregato associati a un aumento del rischio di alti gradi dPVS in BG (Tabella 5). Da notare che questa associazione non è stata guidata da una singola variante di rischio per WMHV (P>0,09 per le singole associazioni SNP-dPVS; Tabella V nel supplemento dati online).

Discussione

In un grande studio basato sulla popolazione di >1500 persone anziane non imparentate senza ictus e demenza, abbiamo trovato alte stime di ereditabilità, derivate dai genotipi genomici, per il carico dPVS, nella stessa gamma delle stime di ereditabilità per WMHV, mentre l’ereditabilità di LI era inferiore. Parte dell’ereditabilità stimata per dPVS e WMHV sembra essere condivisa. Abbiamo trovato la più alta correlazione genetica tra dPVS in BG e WMHV, coerente con l’alta correlazione fenotipica osservata tra WMHV e dPVS in questa posizione. Abbiamo anche trovato un’associazione nominalmente significativa tra un punteggio di rischio genetico che combina varianti di rischio genetico note per WMHV e dPVS in BG.

L’ereditabilità di dPVS non è stata descritta prima a nostra conoscenza. Per WMHV e LI, i nostri risultati sono coerenti con le stime degli studi basati sulla famiglia, che mostrano un’ereditabilità da moderata ad alta per il carico WMH (49%-80%)17-21 e un’ereditabilità più bassa per LI (29%).21 Da notare che le stime di ereditabilità degli studi basati sulla famiglia sono sempre più grandi delle stime di ereditabilità derivate da SNP perché rappresentano solo l’ereditabilità in senso stretto.22

La più forte correlazione genetica di WMHV con il carico di dPVS in BG che in WM rafforza l’ipotesi di processi almeno parzialmente distinti alla base di dPVS in queste 2 sedi.9 Abbiamo precedentemente descritto che la gravità di dPVS in entrambi in BG e WM non necessariamente coincide. Infatti, tra gli individui con grado 4 di dPVS in WM, solo il 23% aveva anche un grado 3 o 4 in BG, e tra gli individui con grado 4 di dPVS in BG, il 42% aveva anche un grado 3 o 4 in WM.3 Noi e altri abbiamo anche dimostrato che i profili dei fattori di rischio vascolare variano a seconda della posizione dPVS.3,23 Questo è ulteriormente confermato dai presenti risultati, che mostrano una correlazione fenotipica più forte e una variazione genetica condivisa tra WMHV e dPVS in BG rispetto alla dPVS in WM. È interessante notare che solo la gravità della dPVS in BG è stata associata a un tasso più elevato di declino cognitivo nelle persone anziane della comunità del 3C-Dijon Study9 e a peggiori prestazioni di velocità di elaborazione in una coorte di pazienti con cSVD o ad alto rischio di cSVD.24 I livelli di interleuchina-6 erano associati a una maggiore gravità della dPVS in BG ma non in WM.25 Quindi, sembrano esserci prove convergenti che la dPVS può avere almeno in parte distinti fattori di rischio sottostanti, compresi quelli genetici, e conseguenze cliniche a seconda della loro localizzazione.

I meccanismi alla base della dilatazione della PVS sono speculativi. Una delle ipotesi è una riduzione della produzione di liquido cerebrospinale con l’invecchiamento, che porta a una diminuzione della clearance linfatica e un accumulo di proteine tossiche.26-28 In parallelo, l’irrigidimento della parete arteriosa che si verifica con l’invecchiamento o la malattia può portare a una riduzione della pulsatilità arteriosa, facilitando la dilatazione della PVS.28,29 Potrebbero essere coinvolte anche l’ipertrofia astrocitaria e la perdita di polarizzazione dell’acquaporina-4 perivascolare, con conseguente disregolazione del trasporto d’acqua astrogliale, nonché la disfunzione della barriera emato-encefalica.30-33 La maggior parte delle ipotetiche vie fisiopatologiche della dPVS derivano da modelli animali. L’esplorazione dei determinanti genetici della dPVS utilizzando un approccio genoma-wide imparziale può fornire ulteriori informazioni sui percorsi biologici alla base della dPVS negli esseri umani, potenzialmente fornendo ulteriori prove per una o più delle ipotesi di cui sopra o suggerendo nuovi meccanismi precedentemente insospettati. Le alte stime di ereditabilità derivate da SNP per il carico della dPVS suggeriscono che la ricerca di determinanti genetici della dPVS potrebbe effettivamente essere un approccio efficiente. Anche se la correlazione genetica tra WMHV e dPVS era relativamente alta, una parte sostanziale del contributo genetico al carico dPVS sembra non essere condivisa con altri marcatori MRI di cSVD, giustificando gli sforzi per decifrare specificamente la genetica del carico dPVS. Aumentare il numero di partecipanti e armonizzare le misure dPVS tra gli studi esistenti,34 così come prendere in considerazione il confondimento e la modifica degli effetti da fattori di rischio ambientali, soprattutto l’ipertensione, sarà importante per gli sforzi futuri.

I punti di forza del nostro studio includono un campione di grandi dimensioni in un ambiente basato sulla popolazione con un’attenta valutazione della dPVS da parte dello stesso lettore esperto utilizzando immagini di risonanza magnetica del cervello intero con una valutazione precisa della forma della dPVS su immagini T1 millimetriche tridimensionali e la differenziazione da WMH e LI utilizzando un attento esame nei 3 piani e l’esplorazione delle sequenze T2 e densità protonica. Gli sforzi per sviluppare una valutazione automatizzata e quantitativa del carico delle dPVS sono in corso, ma non ancora disponibili per un uso su larga scala. Sono stati utilizzati rigorosi criteri di controllo della qualità con rimozione rigorosa degli individui correlati e aggiustamento per i 20 primi PC. Poiché i marcatori MRI della malattia dei piccoli vasi sono fortemente correlati con l’età,3,35 non possiamo escludere un confondimento residuo dovuto all’età, anche se la nostra fascia di età al momento della MRI era relativamente limitata e limitata a individui più anziani (65-80 anni). Potrebbero essere interessanti studi futuri su campioni più grandi che consentano analisi stratificate su fasce d’età più ristrette e che includano anche gruppi di età più giovani in cui il carico della cSVD potrebbe essere più ereditabile. La cautela è garantita quando si interpretano i valori assoluti di ereditabilità e di ereditabilità condivisa, data la dimensione relativamente limitata del campione, soprattutto per le analisi di ereditabilità condivisa che non raggiungono la significatività statistica, e dovrebbero, quindi, essere considerate come esplorative. Un confronto con future analisi simili in campioni indipendenti sarà necessario per ottenere stime più precise.

Conclusioni

Il presente studio fornisce prove preliminari di un importante contributo genetico al carico della dPVS nelle persone anziane della comunità, suggerendo che la ricerca di fattori di rischio genetici della dPVS può essere un modo efficiente per esplorare i meccanismi biologici alla base della dPVS e per identificare gli individui ad alto rischio di cSVD e le sue conseguenze. Ulteriori studi sono anche necessari per esplorare meglio il significato clinico e l’importanza della dPVS, con possibili implicazioni per la prevenzione delle malattie cerebrovascolari e neurodegenerative.

Riconoscimenti

Ringraziamo i partecipanti dello studio 3C, per i loro importanti contributi.

Footnotes