I principi ingegneristici della combinazione di un ciclo di feedforward incoerente trascrizionale con feedback negativo

Un modello di regolazione trascrizionale incoerente feedforward

Ci sono quattro varietà di controllo incoerente feedforward (FF) in un sistema a tre nodi. In questo lavoro, studiamo il motivo incoerente feedforward loop di tipo 1 (I1-FFL), in cui il segnale di ingresso (X) attiva sia l’intermedio (Y) che l’uscita finale (Z), mentre Y reprime Z (Fig. 1a) . Il nostro modello è quello della regolazione trascrizionale, per cui X rappresenta un fattore di trascrizione in ingresso, che può legarsi alle regioni cis-regolatrici di Y e Z, con affinità K1 (Fig. 1b). Questo provoca la trascrizione e la traduzione di Y (doppie frecce in Fig. 1b), che è anche un fattore di trascrizione che si lega alla regione regolatrice di Z con affinità K2. Nel nostro modello, il legame di X e Y è cooperativo (linea tratteggiata in Fig. 1b), così che il loro legame sinergico è descritto da K12 = CK1K2. Il legame cooperativo può avvenire anche tra altri componenti; tuttavia, la cooperatività diversa da quella tra X e Y non è richiesta (vedi file aggiuntivo 1 per l’analisi della cooperatività). Pertanto, manteniamo solo l’unico termine cooperativo necessario per testare le nostre ipotesi, e quindi la nostra analisi principale assume che tutte le altre interazioni di legame siano non cooperative.

Nell’ingegneria del controllo di processo, X è visto come un disturbo al sistema; l’obiettivo del controllo FF standard (che utilizza un motivo IFFL) è quello di respingere l’effetto che X ha su Z. Se il controllore FF è sintonizzato correttamente, la variabile di uscita è mantenuta al suo valore desiderato o vicino (ad es, entro il 5%), sia nel transitorio che nell’uscita finale (Fig. 1c). Al contrario, nei sistemi biologici, X è visto come un segnale di ingresso, e il motivo I1-FFL è spesso progettato in modo che i livelli di Z mostrino una risposta transitoria, per poi tornare (vicino a) il loro valore originale (Fig. 1d). Così, l’altezza del picco e la differenza tra i livelli iniziali e finali di Z rappresentano la metrica delle prestazioni (Fig. 1d).

Qui si modella la I1-FFL come un sistema di equazioni differenziali di ritardo, che sono un’estensione del modello da (Eqs. 1-3 in Metodi). Si noti che X attiva sia Y che Z, con affinità di legame K1, mentre Y reprime Z (anche se X è legato) con affinità di legame K2. Il termine finale nel denominatore di fz è il termine di cooperatività (xy/K12 = xy/(CK1K2)). Vedere Metodi per maggiori dettagli sulla derivazione del modello.

In questo documento, teniamo x = x0 = 1 per t < 0, che si traduce in uno stato stazionario iniziale di y0 e z0. Al tempo t = 0, x sperimenta un aumento a gradino: x(t ≥ 0) = x1 > 1, che si traduce in un aumento iniziale sia di y che di z. Tuttavia, dopo qualche transitorio iniziale, l’aumento di y comincia anche a reprimere z. Per la maggior parte dei valori dei parametri, questo si traduce in un valore di picco di z (zpeak), seguito da un adattamento ad un nuovo valore di stato stazionario, z1 (Fig. 1d). Qui, abbiamo normalizzato il livello di picco e la metrica di adattamento come P ≡ (zpeak – z0)/z0 e f = (z1 – z0)/z0, rispettivamente (vedi Fig. 1d). Per il resto dell’articolo, prenderemo τy = τz = 1, e θy = θz = 0.5.

Il ciclo feedforward incoerente di tipo I può essere sintonizzato per un adattamento perfetto

L’analisi precedente del modello di cui sopra (Eqs. 1-3) ha dimostrato che la regolazione trascrizionale I1-FFL può, nelle giuste condizioni, agire come un rilevatore di fold-change (FCD). Una delle condizioni necessarie per un modello di agire come un FCD è quasi perfetto adattamento (NPA), che si verifica quando lo stato finale, z1, è entro pochi per cento dello stato iniziale, z0 (ad esempio, |f| ≤ ε = 0,05). Mentre il lavoro precedente ha analizzato il modello (Eqs. 1-3) dal punto di vista del FCD, il modello (e I1-FFLs in generale) può produrre diversi altri fenotipi, compresi i fenotipi meno restrittivi di adattamento e generazione di impulsi.

La nostra analisi del modello mostra che è possibile sintonizzare il FFL in modo tale da ottenere un perfetto adattamento (PA). In altre parole, z1 = z0 (curva blu in Fig. 2a, b). Questa condizione si ottiene quando, per dati K1, K2, il valore di C è uguale a CPA, che è dato da Eq. 5 (vedi Metodi). Se il valore di C si discosta leggermente da CPA, PA si perde, ma NPA può essere mantenuto. Qui definiamo CNPA+ e CNPA- come i valori di C in cui f = + ε e -ε, rispettivamente (curve rosse e oro in Fig. 2a, b). Per la maggior parte di questo lavoro, abbiamo impostato ε = 0,05; tuttavia, i nostri risultati non sono materialmente influenzati dal valore preciso di ε (vedi file aggiuntivo 1).

Tuning the I1-FFL for near perfect adaptation. a Dinamica dell’output, z(t), su un aumento di x da 1 a 10 al tempo t = 0. Curva blu: adattamento perfetto. Curve rossa e gialla: adattamento quasi perfetto, tale che |f| = 0,05. b Uscita normalizzata di z(t). Quando le curve sono normalizzate, è chiaro che le curve rosse e gialle raggiungono un adattamento quasi perfetto. c Heatmap del valore di C richiesto per un adattamento perfetto dato K1, K2, per un aumento del passo di x da 1 a 10. Le curve rosse (qui e altrove) rappresentano i contorni i cui valori sono indicati direttamente sul grafico. Si noti che i limiti dell’asse per K1 vanno da un’affinità forte (10- 2) a molto debole (106), mentre quelli per K2 vanno da molto forte (10- 6) a debole (102). d Heatmap della metrica del picco, P. Quando K1 diventa troppo basso, questa metrica scende a valori inaccettabilmente bassi. e Livelli assoluti del picco in uscita. Curve arancioni: P = 0,1 e CPA = 0,01. Queste curve, insieme al contorno zpeak = 0,01, delimitano una regione biologicamente realistica dello spazio dei parametri. f Heatmap della gamma normalizzata di valori C sotto i quali si ottiene NPA. Le curve nere delimitano due regioni in cui l’NPA è ottenibile con qualsiasi valore di C. Nella regione I, Y e Z sono disaccoppiati e cambiano solo leggermente all’aumentare di X. La regione II è descritta come una regione FCD, che richiede l’NPA. Nella regione biologicamente realistica dello spazio dei parametri, i valori di C sotto i quali NPA può essere raggiunto vanno dal 13 al 65% di CPA

Per x1 = 10, una heatmap dei valori di CPA, come funzione di K1, K2, è rappresentata in Fig. 2c. Si noti che la cooperatività è necessaria per ottenere PA: CPA < 1, anche se si avvicina a 1 per K1, K2 ≪ 1 (vedi file aggiuntivo 1 e Fig. 2c). Poiché C rappresenta un parametro di cooperatività del fold-change, valori di C < 1 rappresentano una sinergia positiva: quando X è legato alla regione regolatoria di Z, aumenta la capacità di Y di legarsi, e viceversa. Un limite inferiore per i valori riportati di C in altri sistemi è dell’ordine di 0,01 . Pertanto, poiché i modelli dei processi biologici devono essere vincolati a fenotipi biologicamente realistici, è improbabile che PA possa essere raggiunto nella regione superiore destra dello spazio dei parametri (Fig. 2c).

I valori moderati dello spazio dei parametri corrispondono a fenotipi biologicamente realistici

Dato il limite inferiore approssimativo su C, è ragionevole chiedere quali altri vincoli possono essere posti sul modello. Imponiamo due ulteriori vincoli biologicamente realistici sul modello. In primo luogo, la dimensione del picco relativo, P = (zpeak – z0)/z0, dovrebbe essere maggiore di 0,1 per garantire una risposta di segnalazione di qualità. Una heatmap di P in funzione di K1, K2 è raffigurato in Fig. 2d. Il contorno P = 0.1 risiede all’incirca a K1 = 0.25; questo implica che, se X lega troppo strettamente la regione regolatrice di Z, un aumento di 10 volte di x (da 1 a 10) non produce un forte picco, poiché il promotore Z è già saturo, anche a bassi valori di x.

In secondo luogo, il picco assoluto in z deve essere maggiore di 0.01 (Fig. 2e). Poiché il nostro modello è scalato in modo tale che il massimo valore possibile di z è 1, questo corrisponde all’1% della massima concentrazione possibile di z, data la forza del promotore e il tasso di degradazione. Prendiamo zpeak = 0,01 per essere il valore minimo al fine di ottenere un segnale biologicamente rilevabile, tuttavia, si può rilassare questo valore minimo un po ‘, che non avrebbe un effetto significativo sui nostri risultati. Prendendo questi tre vincoli su CPA, P e zpeak, una piccola regione dello spazio dei parametri K1, K2 è considerata “biologicamente realistica”. Per il contesto, tutti e tre i contorni sono tracciati in Fig. 2e. Di nuovo, questa regione potrebbe essere modificata se vengono scelti altri valori dei vincoli “biologicamente realistici”. Va anche notato che la regione biologicamente realistica delimita anche la regione dello spazio dei parametri in cui l’I1-FFL può agire come un generatore di impulsi o un adattatore perfetto (vedi file aggiuntivo 1).

Sensibilità di NPA rispetto ai parametri I1-FFL

La robustezza è un ulteriore obiettivo che viene spesso imposto sui sistemi biologici. Pertanto, abbiamo analizzato l’intervallo di valori C circa CPA per cui NPA si mantiene. Definiamo ΔCFF ≡ CNPA+ – CNPA-, e abbiamo tracciato una heatmap di ΔCFF/CPA in Fig. 2f (vedi file aggiuntivo 1 per la derivazione di CNPA+ e CNPA-). Ci sono due regioni del K1, K2 spazio dei parametri in cui NPA è raggiunto indipendentemente dal valore di C (vedi file aggiuntivo 1 e Fig. 2f), nessuno dei quali risiede nella regione biologicamente realistica dello spazio dei parametri (regione bianca tratteggiata in Fig. 2f). Nella regione I, il valore di K1 è sufficientemente basso in modo che, anche a x0 = 1, le regioni di regolazione sia di Y che di Z sono sature di X, e quindi, Y e Z sono relativamente insensibili a X (vedi file aggiuntivo 1). Inoltre, nella regione I, K2 è abbastanza grande che Y ha poca influenza su Z. Così, un aumento di x non cambia sensibilmente il valore di z, il che significa che mentre z1 ≈ z0 (in modo che |f| < ε), non c’è un picco nel valore di z (vedi file aggiuntivo 1: Figura S1). Questo scenario non può essere veramente descritto come NPA. Infatti, i nodi dell’IFFL sono disaccoppiati in questa regione, così che il fenotipo biologico, o funzione, dell’IFFL è indistinto da due nodi che agiscono indipendentemente l’uno dall’altro.

La regione II è stata precedentemente riportata non solo come la regione in cui NPA è facilmente raggiungibile, ma anche dove l’I1-FFL può agire come un rivelatore di fold-change (Additional file 1: Figura S2A) . In questo regime, in cui K1 ≫ 1, K2 ≪ 1, e K1K2 < 1, il legame di X è in regime lineare, e z dipende dal rapporto di x/y . D’altra parte, la risposta assoluta di Z è limitata allo 0,01% del suo massimo (Additional file 1: Figura S2B).

Al contrario, nella regione biologicamente realistica dello spazio dei parametri, ΔCFF è limitato al 13% — 65% del CPA (Fig. 2f). Per esempio, per K1 = 1, K2 = 0,1, per mantenere l’obiettivo di NPA, il sistema può tollerare solo una perturbazione del ∼ 30% di CPA. In altre parole, il modello I1-FFL è relativamente sensibile ai cambiamenti di C quando si tratta di NPA. Per aumentare la robustezza del sistema, abbiamo considerato un sistema combinato feedforward/feedback (FF/FB).

Cicli di feedback negativo trascrizionale

In ingegneria, la sensibilità dell’algoritmo di controllo feedforward rispetto ai parametri del modello può essere mitigata dall’azione di un ciclo di feedback negativo (vedi Eq. 6-8 in Methods). Infatti, la retroazione negativa ha dimostrato di conferire robustezza agli obiettivi di performance I1-FFL, come il tempo di salita e di decadimento, in un modello semplificato di regolazione genica. Tuttavia, in contrasto con l’alta frequenza di motivi FFL trascrizionali, è stato precedentemente segnalato che non esistono cicli trascrizionali (oltre l’autoregolazione) nell’organismo modello E. coli . Ulteriori studi suggeriscono che il feedback negativo trascrizionale è raro, forse a causa della natura lenta dei cicli doppio-trascrizionali, pur riconoscendo l’uso diffuso di cicli di feedback negativo misto in cui un ramo è trascrizionale e l’altro ramo è basato su interazioni proteina-proteina. Per indagare ulteriormente, abbiamo analizzato un set di dati recentemente aggiornato delle interazioni trascrizionali di E. coli, e abbiamo trovato 17 casi di cicli di lunghezza 2, cinque dei quali sono a feedback positivo, nove dei quali sono a feedback negativo, e tre dei quali sono misti. Di queste interazioni, uno dei cicli di feedback negativo era incorporato all’interno di più strutture I1-FFL (vedi file aggiuntivo 2).

Un sistema combinato feedforward/feedback è più robusto di uno con solo feedforward

Viste le previsioni sull’efficacia di un ciclo FB per estendere la robustezza di NPA in un motivo IFFL, abbiamo studiato un sistema combinato FF/FB. Abbiamo aggiunto un quarto nodo, W, che è attivato da Z, e reprime Z (Fig. 3a, b). Queste interazioni introducono molteplici nuovi parametri al modello (vedi Metodi), compresi due parametri di affinità di legame (K3, K4) e un ritardo di trascrizione/traslazione in W (θw; vedi Fig. 3b).

Comportamento del sistema combinato FF/FB. a L’aggiunta di W al motivo della rete risulta in un ciclo di feedback negativo che coinvolge Z e W. b Illustrazione del meccanismo di feedback negativo. Z attiva W e viene repressa da W. Illustrazione di Y non mostrata (vedi Fig. 1b). c Dinamica dell’uscita, z(t), su un aumento a gradino di x da 1 a 10 al tempo t = 0 per il sistema combinato FF/FB. Curva blu: adattamento perfetto. Curve rossa e gialla: adattamento quasi perfetto, tale che |f| = 0,05. d Uscita normalizzata di z(t). Quando le curve sono normalizzate, è chiaro che le curve rosse e gialle sono regolate per un adattamento quasi perfetto. Il valore di C necessario per raggiungere NPA è più distante da CPA che per il sistema solo FF. e Heatmap della gamma normalizzata di valori di C sotto i quali si raggiunge NPA. Le curve nere che delimitano le regioni I e II sono analoghe a quelle descritte in Fig. 2. Nella regione biologicamente realistica (definita per il sistema FF/FB), l’intervallo di valori C sotto il quale NPA può essere raggiunto va dal 25 al 100% di CPA. f Heatmap del rapporto degli intervalli di valori C per i quali NPA è raggiunto per il sistema FF/FB vs il sistema solo FF. L’aggiunta di un ciclo FB aumenta la gamma di valori di C del 21–54%

Per confrontare direttamente i due sistemi, abbiamo tracciato il rapporto ΔCFFFB/ΔCFF in Fig. 3f. Per la gamma di valori biologicamente realistici, ΔCFFFB è 21% — 54% più grande di ΔCFF (rapporti di 1,21 — 1,54). (Si noti che la regione biologicamente realistica mostrata nelle Figg. 3e, f è per il sistema FF/FB; vedi file aggiuntivo 1: Figura S3.) Infatti, con l’eccezione di una piccola regione dello spazio dei parametri K1, K2 (vicino alla regione II), il sistema FF/FB è sempre superiore al sistema solo FF (rapporto maggiore di uno). Dato il vantaggio del sistema FF/FB rispetto agli obiettivi NPA, abbiamo poi indagato se le proprietà dinamiche del sistema FF/FB fossero anch’esse vantaggiose.

Come menzionato in precedenza, nella nostra analisi, abbiamo cercato di mantenere solo le interazioni che erano necessarie per spiegare la robustezza del fenotipo NPA. Come tale, solo le interazioni tra X e Y includevano la cooperatività. Possiamo anche incorporare la cooperatività tra X e W, o Y e W, che non influenza qualitativamente il nostro risultato che l’aggiunta del modulo FB al I1-FFL aumenta la robustezza del sistema (file aggiuntivo 1: Figura S4). Inoltre, i nostri risultati non dipendono dalla scelta esatta di ε (Additional file 1: Figure S5).

L’analisi dinamica rivela che il sistema FF/FB è superiore a quello con il solo FB

I loop di feedback negativo sono afflitti da molteplici svantaggi. In primo luogo, la retroazione proporzionale (che è il meccanismo più comune che si verifica naturalmente nei sistemi biologici) risulta sempre in un offset (vedi Fig. 4a). In altre parole, dopo che un disturbo sconvolge il sistema, l’uscita non ritorna al suo valore originale. Per mitigare questo, si può aumentare la forza della risposta di retroazione negativa. Tuttavia, questo spesso si traduce nel secondo grande svantaggio della retroazione negativa: instabilità dinamiche e/o oscillazioni ad anello possono risultare da una forte retroazione negativa, specialmente in sistemi con ritardi sostanziali (Fig. 4b) . D’altra parte, se il disturbo primario può essere parzialmente o completamente respinto da un FFL, entrambi gli svantaggi possono essere evitati (Fig. 4a, b). Per studiare questi principi in un sistema di regolazione genica, abbiamo confrontato il comportamento di un modello solo FB con un modello combinato FF/FB. Per illustrare l’instabilità dinamica, abbiamo impostato il coefficiente di Hill per tutte le interazioni di legame del DNA a n = 2 (vedi file aggiuntivo 1).

Dinamica dei sistemi solo FB e combinato FF/FB. a Un feedback negativo (proporzionale) da solo (curva blu), alla perturbazione, risulta sempre in offset dal valore originale. Anche un sistema combinato FF/FB comparabile può mostrare un offset; tuttavia, l’I1-FFL nel sistema FF/FB può essere regolato per un perfetto adattamento. Il sistema FF/FB può anche avere un approccio più rapido allo stato stazionario. b L’aggiunta di un I1-FFL al sistema FB può risultare in una dinamica più stabile. Per questa scelta di parametri, il sistema solo FB è instabile, mentre il sistema FF/FB è stabile. c Mappa termica della parte reale dell’autovalore principale (α) per il sistema solo FB. La curva nera è il contorno per cui α = 0, che indica il limite di stabilità del sistema solo FB. Valori più piccoli di K4 risultano in un sistema instabile (vedi parte B). Qui e altrove, i valori di α per altri contorni (curve rosse) sono indicati direttamente sul grafico. d Come C, ma per il sistema combinato FF/FB. e Heatmap di Δα, la differenza tra le parti reali degli autovalori principali per i due sistemi. Sul lato destro del contorno zero, i valori di Δα sono maggiori di zero, indicando che il sistema FF/FB ha un approccio più rapido allo stato stazionario. Le curve bianche e nere indicano i limiti di stabilità per i sistemi solo FB e FF/FB, rispettivamente (vedi anche le parti C, D)

Per determinare la stabilità dei sistemi solo FB e combinati FF/FB, abbiamo calcolato α, la parte reale dell’autovalore principale (vedi file aggiuntivo 1), per valori variabili di K3, K4 (per il sistema FF/FB, abbiamo impostato K1 = 1, K2 = 0,1; Fig. 4c, d). Mentre nessuno dei due sistemi è chiaramente superiore all’altro, per una moderata attivazione di W da parte di Z (K4 ≈ 0.1 o maggiore), un forte feedback negativo (K3 < 0.1) tende a provocare un sistema solo FB instabile, mentre il sistema FF/FB è sempre stabile. Infatti, αFB – αFFFB > 0 per questa regione di moderata attivazione di W (Fig. 4e). Anche quando entrambi i sistemi sono stabili, αFFFB < αFB implica che il sistema FF/FB raggiunge lo stato stazionario più velocemente (vedi, per esempio, Fig. 4a). Tuttavia, l’aggiunta di un secondo livello di controllo può spesso comportare dei compromessi, dove un vantaggio ottenuto in un’area comporta uno svantaggio in un’altra. Pertanto, confronteremo le prestazioni dei modelli solo FB e combinati FF/FB per quanto riguarda altri due obiettivi: il picco normalizzato, P, e il picco assoluto, zpeak.

Un sistema combinato FF/FB raggiunge il compromesso su più obiettivi

Per confrontare le prestazioni del sistema FF/FB con quelle del sistema solo FB, abbiamo calcolato il valore di picco di z in entrambi i sistemi mentre variavamo K3, K4 da 0,01 a 1. In primo luogo, abbiamo trovato il picco normalizzato, P, del sistema solo FB variava da circa 0,7 a 1 (Fig. 5a). D’altra parte, il picco normalizzato per il sistema FF/FB è quasi indipendente dai valori K3, K4 ed è circa 1,256 (vedi file aggiuntivo 1: Figura S6). Pertanto, il sistema FF/FB supera il sistema solo FB anche su questa metrica: il sistema FF/FB è un miglioramento del 30-80% rispetto al sistema solo FB (Fig. 5b).

Confronto delle metriche di performance del sistema solo FB con il sistema combinato FF/FB. a Heatmap del picco normalizzato, P, per il sistema solo FB. Questo parametro (e altri definiti in questa figura) è indefinito per i sistemi instabili. b Rapporto di P per il sistema FF/FB con quello per il solo FB. Secondo questa metrica, il sistema FF/FB supera sempre il sistema solo FB. Tuttavia, la metrica PFFFB è approssimativamente costante a 0,46, indipendentemente dai valori di K3, K4 (vedi file aggiuntivo 1). c Heatmap del picco assoluto, Zpeak, per il sistema FF/FB e valori variabili di K3, K4. Si noti che il valore di picco assoluto è, nel migliore dei casi, 0,06. Anche se questo è basso, è adeguato. d Rapporto del picco assoluto per il sistema FF/FB con quello del solo FB. Secondo questa metrica, il sistema solo FB supera sempre il sistema FF/FB (rapporto minore di uno). Tuttavia, dati gli altri obiettivi di performance per i quali il sistema FF/FB è superiore, questo è un compromesso accettabile

Un grande svantaggio del sistema combinato è che, con due repressori dell’uscita (Y e W), i livelli dell’uscita (rispetto ai suoi livelli massimi possibili) sono bassi. Per i valori dei parametri scelti (K1 = 1, K2 = 0,1), zpeak rimane sopra il limite inferiore di 0,01 (vedi Fig. 2e). Tuttavia, questo è significativamente inferiore al valore di zpeak visto nel sistema solo FB (Fig. 5d). Nel complesso, il sistema combinato FF/FB è superiore nella sua dinamica e nel valore di picco normalizzato, pur compromettendo il valore di picco assoluto.