Genetica della miastenia gravis: uno studio di associazione caso-controllo nella popolazione ellenica

Abstract

La miastenia gravis (MG) è una malattia autoimmune eterogenea caratterizzata dalla produzione di autoanticorpi contro le proteine della membrana postsinaptica, nella giunzione neuromuscolare. Il contributo dei fattori genetici alla suscettibilità alla MG è stato valutato attraverso studi familiari e gemellari, tuttavia, il preciso background genetico della malattia rimane elusivo. Abbiamo condotto uno studio di associazione caso-controllo in 101 pazienti MG non imparentati di origine ellenica e 101 volontari sani per valutare il coinvolgimento di varianti genetiche comuni nella suscettibilità alla MG. Ci siamo concentrati su tre geni candidati che sono stati chiaramente associati a diverse malattie autoimmuni, allo scopo di indagare la loro potenziale implicazione nella patogenesi della MG. Questi sono il fattore di regolazione dell’interferone 5 (IRF-5), la proteina 3 indotta dal TNFα (TNFAIP3), nota anche come A20, e l’interleuchina-10 (IL-10), molecole chiave nella regolazione della funzione immunitaria. È stata rivelata una tendenza statistica di associazione () tra i polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) del promotore di IL-10 e i sottogruppi di pazienti con MG a esordio precoce e tardivo. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata nel resto delle varianti esaminate. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo tentativo a livello mondiale di affrontare la possibile associazione tra le varianti genetiche comuni di IRF-5 e TNFAIP3 e la base genetica della MG.

1. Introduzione

La miastenia gravis (MG) è una malattia autoimmune organo-specifica causata da autoanticorpi diretti contro le proteine della membrana postsinaptica che portano a una trasmissione neuromuscolare compromessa. Clinicamente, la MG è caratterizzata da debolezza muscolare e affaticamento rapido aggravato dall’esercizio e alleviato dal riposo. Il principale autoantigene, nell’80-90% dei pazienti con MG, è il recettore muscolare dell’acetilcolina (AChR), un canale pentamerico che media la trasduzione sinaptica alla giunzione neuromuscolare. In molti dei rimanenti pazienti con MG, vengono rilevati autoanticorpi contro la tirosin-chinasi muscolo-specifica (MuSK) o contro la proteina 4 legata alle lipoproteine (LRP4). Sia MuSK che LRP4 formano un complesso recettoriale che lega il proteoglicano della matrice extracellulare agrina, con conseguente raggruppamento di AChR, critico per la funzione della giunzione neuromuscolare.

Anche se la MG è una malattia che colpisce entrambi i sessi, a tutte le età e in tutte le razze, l’evidenza di diversi studi epidemiologici ha mostrato una distribuzione bimodale dipendente dal sesso e dall’età del tasso di incidenza, con un picco nella seconda e terza decade di vita, osservato soprattutto nelle donne, e il secondo nella sesta e settima decade di vita che si verifica principalmente negli uomini. L’osservazione di cui sopra ha portato alla classificazione della MG in esordio precoce che appare prima dei 50 anni di età ed è di solito legata all’iperplasia del timo e MG ad esordio tardivo (>50 anni) con timo normale o atrofico.

L’entità del contributo genetico alla suscettibilità della MG è stata valutata attraverso studi familiari e gemellari, che riflettono il raggruppamento familiare della malattia e successivamente l’ereditarietà genetica. Gli alti tassi di concordanza della MG osservati tra i gemelli monozigoti rispetto ai gemelli dizigoti suggeriscono fortemente il coinvolgimento di fattori genetici nella patogenesi della MG. Inoltre, diversi studi hanno riportato che i pazienti con MG possono essere affetti da un’altra malattia autoimmune, più frequentemente, disturbi tiroidei e artrite reumatoide. Questa scoperta porta all’ipotesi che si verifica un disturbo più generalizzato della funzione immunologica.

Il complesso dell’antigene leucocitario umano (HLA) è la regione genomica prominente implicata nell’insorgenza della MG. Gli alleli HLA-A1 e B8 per la classe I e DR3 per la classe II costituiscono un aplotipo ancestrale chiamato “8.1” che è stato associato in modo riproducibile all’insorgenza precoce della MG e all’iperplasia timica. Ulteriori ricerche orientate alla dissezione di questo aplotipo esteso A1-B8-DR3, hanno portato all’identificazione del locus MYAS1, una regione di 1,2 Mb che comprende 36 geni, al confine tra la classe III e la regione prossimale della classe I, escludendo così i loci di classe II e confermando l’associazione predominante dell’allele B8 su quello DR3.

Oltre all’HLA, un certo numero di loci genetici non collegati all’HLA sono stati studiati per quanto riguarda il loro coinvolgimento nella suscettibilità alla MG. Questi risultati sono stati derivati principalmente da studi sui geni candidati, mentre i geni che sono stati segnalati come associati o non associati alla MG sono discussi in dettaglio in .

Il fattore 5 di regolazione dell’interferone (IFN) (IRF-5) è un membro della famiglia IRF dei fattori di trascrizione. IRF-5 è attivato da IFN-α/B e upregola una serie di citochine proinfiammatorie, come IL-6, TNF-α e IL-12, mentre induce ulteriormente l’espressione del gene IFN. I risultati di diversi studi, rivisti in , hanno implicato IRF-5 come un gene di suscettibilità nel LES. La ricerca di varianti comuni che influenzano i livelli di IRF-5 ha portato all’identificazione dello SNP rs10954213 (c.*555G > A), situato all’interno della sequenza di segnale polyA+ AATAAA nel 3′ UTR. L’allele G interrompe il sito di poliadenilazione e la trascrizione viene terminata molto a valle, producendo così trascrizioni di IRF-5 mRNA più lunghe e meno stabili. Inoltre, una variante di inserzione-delezione in-frame di 30 bp (rs60344245) nel sesto esone di IRF-5 determina la formazione di due famiglie di isoforme proteiche che hanno capacità differenziale di avviare la trascrizione dei geni bersaglio IRF-5.

La proteina 3 indotta dal TNFα (TNFAIP3), nota anche come A20, è una molecola chiave nella regolazione a feedback negativo delle risposte NF-κB-dipendenti. L’effetto inibitorio di TNFAIP3 sulla segnalazione di NF-κB è generato dall’attività cooperativa dei suoi due domini di ubiquitina-editing: il dominio N-terminale del tumore ovarico (OTU), responsabile della deubiquitinazione della proteina di interazione del recettore 1 (RIP1), una proteina adattatrice essenziale della via di segnalazione indotta dal TNF, e il dominio C-terminale contenente il dito di zinco, che funziona come una ligasi E3 ubiquitina che promuove la degradazione proteasomiale di RIP1 .

Lo SNP rs13207033 (g.137965418G > A), situato nella regione intergenica 6q23, circa 185 kb a monte di TNFAIP3, probabilmente influenza l’espressione genica attraverso la presenza di potenziali elementi regolatori del DNA. Un altro studio ha indicato che un SNP codificante non sinonimo (c.380T > G, rs2230926) risultante in un cambiamento fenilalanina-cisteina al residuo 127 (p.F127C), nel dominio OTU della proteina TNFAIP3, è associato con SLE tra gli individui di ascendenza europea.

L’interleuchina-10 (IL-10) è una citochina pleiotropica secreta da diversi tipi di cellule, come le cellule T e le cellule della linea mieloide. IL-10 è stata caratterizzata come una citochina antinfiammatoria grazie ai suoi effetti stimolatori sulle cellule TH2 e alla contemporanea soppressione delle cellule TH1. Inoltre, IL-10 induce la proliferazione e la differenziazione dei linfociti B attivati, portando ad un’ulteriore attivazione della risposta umorale. Nella MG autoimmune sperimentale (EAMG), la somministrazione di IL-10 ha causato l’aumento dei livelli di anticorpi anti-AChR, suggerendo un ruolo di rafforzamento della malattia di IL-10.

Sono state notate diverse varianti nella sequenza 5′ flanking del gene umano IL-10. Tre SNPs, vale a dire, rs45552637 (A/C), rs1800872 (T/C), e rs1800896 (A/G), situati alle posizioni -592, -819, e -1082, rispettivamente, determinano la formazione di tre aplotipi (GCC, ACC, e ATA). La posizione di questi SNP è basata sulla sequenza precedentemente pubblicata U16720, depositata nel database EMBL-EBI. Uno studio di Turner e collaboratori ha riportato la correlazione di questi aplotipi con la produzione della proteina IL-10 in vitro. In particolare, il genotipo GCC/GCC è stato associato a un’elevata produzione di IL-10 indotta da concanavalina A, i genotipi GCC/ACC e GCC/ATA a una produzione media e i genotipi ACC/ACC, ATA/ATA e ACC/ATA a una bassa produzione di IL-10.

Nello studio attuale, è stato adottato un approccio guidato dall’ipotesi per valutare il coinvolgimento di alcune varianti comuni nella suscettibilità alla MG. Così, abbiamo condotto uno studio caso-controllo sui geni candidati, concentrandoci sui geni con un ruolo critico nella funzione del sistema immunitario, allo scopo di identificare se le associazioni precedentemente riportate tra i suddetti geni e altre malattie autoimmuni potessero valere per la MG.

2. Materiali e metodi

2.1. Popolazione di studio

In questo studio sono stati arruolati 101 pazienti con MG non imparentati, tutti di origine ellenica. I campioni di sangue dei pazienti con MG sono stati raccolti presso l’Istituto Pasteur ellenico durante l’indagine diagnostica di routine. Solo i pazienti MG AChR-positivi sono stati inclusi nel nostro studio. La diagnosi di MG si è basata sulla presenza di anticorpi anti-AChR nel siero del paziente, utilizzando un test di radioimmunoprecipitazione (RIPA). Abbiamo intenzionalmente escluso dall’analisi genetica quei pazienti che sono stati identificati come positivi per gli autoanticorpi contro MuSK, al fine di ridurre l’eterogeneità del gruppo di studio. Anche se i sieri dei pazienti con MG non sono stati analizzati per gli autoanticorpi anti-LRP4, l’assenza di questo test non solleva alcun problema di eterogeneità nella popolazione in studio, a causa della rara coesistenza di anticorpi anti-LRP4 e anti-AChR. Le caratteristiche principali del gruppo MG anti-AChR (età all’esordio e sesso) sono riassunte nella tabella 1. I pazienti hanno ottenuto il consenso informato scritto. Il gruppo di controllo consisteva di 101 individui sani etnicamente e sessualmente compatibili.

2.2. Genotipizzazione

Il DNA genomico di ogni individuo è stato estratto da un campione di sangue venoso periferico utilizzando il kit QIAamp Blood Midi (Qiagen GmbH, Hilden, Germania). Le reazioni a catena della polimerasi (PCR) sono state eseguite con il kit KAPA2G Fast HotStart ReadyMix (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA). Sequenze di primer sono presentati nei materiali supplementari come tabella supplementare 1 (vedi tabella 1 nel materiale supplementare disponibile online a http://dx.doi.org/10.1155/2012/484919), mentre le condizioni di reazione sono disponibili su richiesta.

L’amplificazione mediante PCR e l’analisi di elettroforesi su gel di agarosio sono stati utilizzati per genotipizzare la variante di inserzione/delezione 30 bp di IRF5.

Saggio di polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) basato sulla PCR è stato utilizzato per l’individuazione di SNP rs2230926 (T > G) in TNFAIP3. I frammenti amplificati di 549 bp sono stati digeriti con l’enzima di restrizione Fnu4HI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) e sono stati poi analizzati mediante separazione elettroforetica su gel di agarosio al 2% w/v. L’allele G crea un sito di restrizione Fnu4HI, con conseguente digestione degli ampliconi in frammenti di 319 e 230 bp.

L’identificazione dei genotipi SNPs del promotore di IL-10 è stata eseguita mediante sequenziamento diretto del DNA Sanger. Un frammento di 585 bp, comprendente tutte e tre le varianti, è stato amplificato mediante PCR. I prodotti della PCR sono stati purificati dal kit di purificazione PCR PureLink su colonna (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La sequenza del frammento di 585 bp è stata determinata utilizzando il kit BigDye Terminator chemistry v3.0 su un sequenziatore di DNA Applied Biosystems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). I primer utilizzati erano gli stessi di quelli per l’amplificazione di questa regione.

Entrambi gli SNP, rs10954213 (A/G) nel 3′ UTR di IRF5 e rs13207033 (G/A) situato in una regione intergenica 6q23, sono stati genotipizzati mediante PCR in tempo reale e analisi della curva di fusione ad alta risoluzione (HRM) su un ciclatore in tempo reale RotorGene Q (Qiagen GmbH, Hilden, Germania). L’amplificazione del frammento contenente lo SNP di interesse è stata effettuata utilizzando il kit Type-it HRM PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Germania), secondo le istruzioni del produttore. Durante l’HRM, la temperatura aumenta da 65 a 95°C, con una velocità di riscaldamento di 0,1°C/2 sec, portando alla denaturazione dei prodotti di PCR e alla generazione di curve di fusione, caratteristiche per ogni genotipo. Poiché un cambiamento di una singola coppia di basi provoca uno spostamento significativo della temperatura di fusione (), la genotipizzazione si basa sull’analisi dei profili di fusione: gli omozigoti per l’allele A mostrano profili di fusione simili e con una minore , rispetto agli omozigoti G/G, mentre gli eterozigoti sono differenziati da un cambiamento nella forma della curva di fusione.

Nessun controllo di template è stato meticolosamente incluso in tutti i processi di genotipizzazione. I campioni di controllo negativi e positivi sono stati inizialmente identificati tramite sequenziamento del DNA e sono stati, successivamente, utilizzati in tutti i metodi di genotipizzazione. Ogni campione è stato testato in duplicato, tranne quelli analizzati mediante PCR-RFLP e sequenziamento del DNA.

2.3. Analisi statistica

Le differenze nella distribuzione dei genotipi e nelle frequenze alleliche tra i casi e i controlli sono state calcolate mediante analisi o test esatto di Fisher. valori inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

3. Risultati

Le distribuzioni dei genotipi di tutte le varianti erano coerenti con l’equilibrio di Hardy-Weinberg in entrambi i gruppi di pazienti MG e di controllo (dati non mostrati).

Le frequenze alleliche e genotipiche della variante IRF-5 rs60344245 hanno mostrato una distribuzione analoga nei gruppi esaminati di 101 pazienti con MG e 100 controlli (). Per quanto riguarda lo SNP IRF-5 rs10954213, il genotipo A/G è risultato essere un po’ più frequente nei pazienti con MG che nei controlli (54,8% contro 45,5%), ma l’analisi non ha rivelato alcuna differenza significativa (). Le frequenze alleliche e genotipiche di entrambe le varianti IRF-5 sono riportate nella tabella 2.

La frequenza del genotipo TNFAIP3 rs13207033 G/G ha mostrato un aumento nei controlli sani (44,6%) rispetto ai pazienti MG (33,3%). Tuttavia, l’analisi statistica non ha indicato alcuna differenza significativa tra i due gruppi (). Nel caso dello SNP codificante rs2230926, i genotipi sono distribuiti in modo simile nei 73 pazienti con MG e negli 81 controlli esaminati, come si deduce dal valore . Le frequenze genotipiche della variante rs2230926, sia nei pazienti con MG che nei controlli, sono in accordo con quelle derivate da campioni di origine europea (CEU) che fanno parte del progetto internazionale HapMap. Inoltre, il nostro gruppo di studio ha mostrato frequenze di genotipi rs13207033 che sono paragonabili alle frequenze riportate nelle popolazioni europee, nel database dbSNP. I risultati di genotipizzazione delle due varianti TNFAIP3 sono riassunti nella tabella 3.

Età di insorgenza della malattia è stata anche valutata dividendo i pazienti MG in pazienti ad insorgenza precoce e tardiva. Nessuna differenza significativa nella distribuzione dei genotipi è stata rilevata tra i due sottogruppi e il gruppo di controllo (dati non mostrati).

L’analisi della sequenza del DNA della regione promotrice di IL-10 ha mostrato che il genotipo ACC/GCC era il genotipo più frequentemente osservato sia nei pazienti con MG che nei controlli (23,72% e 28%, rispettivamente), seguito dal genotipo a bassa secrezione ATA/ACC, che è stato rilevato nel 21,62% del totale MG e nel 18% dei controlli (Tabella 4). Tuttavia, lo studio attuale non ha rivelato alcuna differenza statisticamente significativa nella distribuzione dei genotipi IL-10 tra la coorte completa di pazienti con MG (cioè, MG totale) e il gruppo di controllo (). Il confronto tra i sottoinsiemi in base all’età di insorgenza ha dimostrato che il genotipo GCC/GCC ad alta secrezione di IL-10 si trova con una bassa frequenza nella MG ad insorgenza precoce (4%), mentre è sovrarappresentato nei casi di MG ad insorgenza tardiva (20%) (Tabella 4). È stata rivelata una tendenza statistica di associazione () tra la distribuzione del fenotipo IL-10 e i due sottogruppi di esordio precoce e tardivo (Figura 1).

4. Discussione

La MG è una malattia autoimmune eterogenea con una chiara predisposizione genetica. Oltre ai loci HLA, diverse varianti comuni nei geni non collegati all’HLA sono state associate alla suscettibilità alla MG. Molti di questi geni associati al rischio sono ampiamente distribuiti tra varie malattie autoimmuni, sostenendo la nozione che le malattie autoimmuni sono caratterizzate da percorsi patogenetici condivisi. In questo studio, abbiamo eseguito uno studio di associazione caso-controllo per indagare il contributo delle varianti comuni situate nei geni IRF-5, TNFAIP3 e IL-10 alla suscettibilità MG. Questi geni sono stati considerati come buoni candidati a causa del loro ruolo critico nella regolazione della risposta immunitaria e la loro implicazione precedentemente nota nel processo autoimmune. Solo i pazienti con anticorpi anti-AChR nel loro siero sono stati inclusi nell’analisi genetica, poiché ci si aspettava che essi rappresentassero un sottogruppo più omogeneo rispetto al più ampio gruppo MG. Questo sottogruppo è stato ulteriormente suddiviso in due entità di malattia distinte: i pazienti con MG ad esordio precoce, che comprendono soprattutto le donne, e i pazienti con MG ad esordio tardivo, che mostrano una percentuale più elevata di uomini.

Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio, in qualsiasi popolazione, ad indagare l’associazione tra MG e varianti comuni dei geni IRF-5 e TNFAIP3. Secondo studi precedenti, rivisti in , diverse varianti nel locus IRF-5 sono state associate in modo riproducibile con il LES, implicando IRF-5 come un gene di suscettibilità nel lupus. L’rs10954213 SNP è stato trovato per influenzare la poliadenilazione dell’mRNA, quindi, compromettendo i livelli di proteina IRF-5; gli omozigoti A/A esprimono circa 5 volte più alti livelli di IRF-5 immunoreattivo rispetto agli omozigoti G/G. Come per la variante rs60344245, la delezione di 30 bp (GGCCGCCTACTCTGCAGCCGCCCACTCTGC/-) rimuove 10 aminoacidi dalla proteina IRF-5 e altera un dominio ricco di prolina, acido glutammico, serina e treonina (PEST). Nella famiglia delle proteine IRF, tali domini partecipano alle interazioni proteiche e causano anche una rapida degradazione proteolitica. Nonostante il loro ovvio ruolo funzionale, lo studio attuale non è riuscito a dimostrare un’associazione significativa delle varianti IRF-5 rs10954213 e rs60344245 con MG ( e , rispettivamente), suggerendo che IRF-5 potrebbe non essere coinvolto nella patogenesi MG.

Inoltre, recenti risultati di studi GWA hanno rivelato associazioni significative tra varianti nel locus TNFAIP3 umano e un ampio spettro di malattie autoimmuni. Una scansione GWA di pazienti con artrite reumatoide, con anticorpi anticitrullina peptide, ha rilevato forti prove di associazione del rs13207033 SNP con lo sviluppo di RA . Allo stesso modo, uno studio di Musone e collaboratori ha riportato l’associazione dello SNP codificante nonsinonimo, rs2230926 con il LES. Studi funzionali per determinare l’impatto biologico di rs2230926 hanno dimostrato che la proteina minore Cys127 mostra una ridotta attività inibitoria . Tuttavia, la mancanza di associazione è stata osservata tra MG e TNFAIP3 rs13207033 () e rs2230926 () SNPs.

Insieme, i nostri dati possono indicare che l’organo-specifico MG potrebbe avere un diverso background genetico che porta alla sua separazione da un ampio cluster di malattie autoimmuni sistemiche che comprendono SLE e RA . Una spiegazione alternativa per la mancanza di associazione nel nostro studio potrebbe essere legata al potere statistico insufficiente a causa delle dimensioni relativamente piccole del campione. Come è generalmente noto, le varianti comuni rappresentano una parte modesta del rischio genetico relativo alle malattie autoimmuni. In questi casi, migliaia di campioni possono essere necessari per rilevare un segnale di associazione che possa essere distinto dal rumore di fondo. Tuttavia, nelle malattie a bassa prevalenza, come la MG, il reclutamento di campioni di grandi dimensioni è molto difficile. Vale la pena ricordare che l’unità diagnostica di MG dell’Istituto Pasteur ellenico è l’unica unità in Grecia che ha sistematicamente ricevuto e analizzato campioni di sangue dal 1983. Pertanto, la nostra collezione di campioni di DNA di MG è attualmente la più grande in Grecia e si arricchisce costantemente di nuovi casi.

Inoltre, nonostante la selezione specifica dei pazienti anti-AChR e la loro divisione in precoce e tardiva, un’ulteriore classificazione in base alle anomalie del timo (timoma o iperplasia) avrebbe potuto essere informativa; tuttavia, i dati istologici non erano disponibili.

Infine, un risultato inaspettato è stata la mancanza di associazione degli SNPs promotori di IL-10 con MG. Poiché si presume che queste varianti si trovino all’interno della regione del promotore di IL-10, potrebbero influenzare il legame dei fattori di trascrizione che regolano l’espressione di IL-10. Un recente studio di Alseth e collaboratori, condotto sulla popolazione norvegese, ha rivelato un’associazione del genotipo ACC/ACC con il sottogruppo di pazienti MG positivi agli anticorpi alla titina, mentre un aumento statisticamente significativo della frequenza ATA/ATA è stato osservato nei pazienti MG ad esordio precoce. Nel nostro gruppo di casi di MG ellenici, non è stata rilevata alcuna prova di associazione, quando abbiamo confrontato la distribuzione dei genotipi tra la coorte completa di pazienti MG e il gruppo di controllo (). Tuttavia, il genotipo GCC/GCC ha rivelato una tendenza statistica di associazione con MG, nei sottogruppi distinti di pazienti con MG a esordio precoce e tardivo (). Pertanto, ulteriori studi su campioni più grandi potrebbero scoprire possibili associazioni di MG con IL-10. È anche degno di nota il fatto che le frequenze alleliche per un dato SNP possono variare sostanzialmente tra i gruppi etnici. La differenza notata nella frequenza del genotipo ACC/ACC tra i gruppi di controllo norvegese ed ellenico (3,4% contro 15%) riflette questa condizione.

Nel complesso, questo è stato il primo sforzo, a nostra conoscenza, per affrontare la possibile associazione tra varianti genetiche comuni di IRF-5 e TNFAIP3 e la base genetica della MG, in qualsiasi popolazione, mentre ulteriori studi sono necessari per svelare il background genetico, ancora largamente sconosciuto, della MG.

Riconoscimenti

Gli autori sono grati ai pazienti e ai volontari di MG che hanno partecipato al nostro studio. Si ringraziano Anna Kokla e Maria Belimezi dell’Hellenic Pasteur Institute per l’assistenza nella raccolta di campioni di pazienti con MG. Il presente studio è stato finanziariamente supportato da sovvenzioni della Commissione Europea Fight MG a S. J. Tzartos e GEN2PHEN (FP7-200754) a G. P. Patrinos, con la partecipazione di fondi del progetto Thales (Autoimmunità) a S. J. Tzartos e K. Poulas e Hellas/Turkey Bilateral Collaboration project (MuSK-myasthenia gravis) a K. Poulas.

Materiale supplementare