Enterococchi

2.4.3.2 Attività idrolitiche degli enterococchi

Gli enterococchi sono noti per produrre tre tipi di enzimi che contribuiscono alla loro patogenicità opportunistica: ialuronidasi, gelatinasi e serina proteasi . La ialuronidasi, codificata dal gene cromosomico hyl, degrada il principale costituente della matrice extracellulare delle cellule ospiti, l’acido ialuronico, facilitando l’invasione dei tessuti e la diffusione delle tossine.

La gelatinasi, codificata dal gene cromosomico gelE, è una metalloproteasi dello zinco attiva sulla gelatina ma anche su collagene, caseina, emoglobina, β-insulina e altri peptidi biologicamente attivi. Questo enzima contribuisce anche al processo di formazione del biofilm, che può facilitare la colonizzazione dei tessuti e la persistenza nei siti di infezione, . La serina proteasi, codificata dal gene sprE, situato a monte di gelE e co-trascritto con quest’ultimo, partecipa anche alla patogenesi degradando i tessuti dell’ospite .

Gli enterococchi contribuiscono allo sviluppo dei sapori del formaggio durante la maturazione grazie alle loro attività proteolitiche e lipolitiche e alla loro capacità di produrre acidi grassi volatili o a lunga catena, diacetile, acetoina e altri composti volatili . Secondo , E. faecium è coinvolto nello sviluppo di gusto, aroma, colore e consistenza. Contribuisce quindi al profilo sensoriale globale di alcuni formaggi. Queste qualità lo rendono anche una flora di scelta per altri prodotti fermentati come le verdure o le carni.

Mentre le attività proteolitiche dei batteri lattici sono ben descritte nella letteratura sui prodotti fermentati, quelle degli enterococchi sono meno note. Sono piuttosto basse nei prodotti lattiero-caseari, ad eccezione di alcuni ceppi di E. faecalis. Secondo , all’interno di questo genere, il livello di attività proteolitica dipende dalla specie e dal ceppo all’interno della stessa specie. Le proteasi meglio descritte sono in grado di idrolizzare la caseina ma anche la β-lattoglobulina e l’α-lattoalbumina. Molti studi dimostrano che i formaggi prodotti da latte inoculato con E. faecalis hanno attività proteolitiche più elevate rispetto ai formaggi prodotti senza questi enzimi. Lavori sulla crescita di 24 ceppi di E. faecium e 60 ceppi di E. faecalis in latte scremato a 37°C, mostrano che le attività proteolitiche di E. faecalis sono molto superiori a quelle di E. faecium. Questi risultati sono confermati da e nei prodotti lattiero-caseari e da su enterococchi isolati da uova intere liquide pastorizzate e responsabili del loro deterioramento.

La successiva degradazione degli amminoacidi è considerata avere un impatto importante sullo sviluppo dell’aroma dei formaggi. Le attività proteolitiche possono anche essere responsabili della formazione di ammine biogene da parte degli enterococchi a partire dagli amminoacidi che essi (o altri tipi di batteri) hanno rilasciato. La figura 2.6 mostra le diverse ammine biogene che si formano potenzialmente negli alimenti in fase di deterioramento.

Figura 2.6. Formazione di ammine biogene nelle matrici alimentari in risposta alle attività metaboliche microbiologiche. Le frecce grigie rappresentano le reazioni di decarbossilazione che portano direttamente alla formazione di ammine biogene, le linee tratteggiate indicano le ammine biogene prodotte attraverso vie metaboliche che differiscono dalle reazioni di decarbossilazione one-step.

(Figura tratta da , adattata secondo )

L’istamina, la tiramina, la feniletilamina e la cadaverina sono prodotte da una reazione di decarbossilazione a una fase dai loro rispettivi precursori istidina, tirosina, fenilalanina e lisina. La produzione di queste ammine biogene, seguita dalla loro secrezione, richiede (1) sistemi di trasporto attivo degli amminoacidi precursori, (2) decarbossilazioni e (3) sistemi di escrezione delle ammine derivanti da queste decarbossilazioni. Il trasporto coinvolge generalmente una proteina che scambia l’aminoacido precursore con l’ammina risultante dalla sua decarbossilazione. Una volta nella cellula, l’amminoacido subisce una decarbossilazione catalizzata da una decarbossilasi specifica (carbossilasi EC 4.1.1.1.) in presenza di piridossal fosfato. Le decarbossilasi più studiate sono la decarbossilasi dell’istidina (HDC), la decarbossilasi della tirosina (TDC) e la decarbossilasi della lisina (LDC), codificate rispettivamente dai geni hdcA, tdcA e cadA. In seguito sono organizzati in operoni con altri geni coinvolti in altre fasi del processo di produzione delle ammine biogene, come il trasporto e la maturazione. La specificità di queste decarbossilasi è stata a lungo dibattuta ed è ormai assodato che una decarbossilasi può decarbossilare diversi substrati. Per esempio, Enterococcus TDC può decarbossilare fenilalanina e tirosina per produrre rispettivamente feniletilamina e tiramina. Putrescina, agmatina, spermidina e spermina sono sintetizzati da diversi percorsi catalizzati da gruppi di geni che possono essere specifici della specie o del ceppo perché sono potenzialmente acquisiti per trasferimento orizzontale.

Gli enterococchi sono descritti come capaci di provocare attività di decarbossilasi responsabili della produzione di ammine biogene negli alimenti fermentati. Sono persino riconosciuti come aventi le più forti attività di decarbossilasi di tirosina e fenilalanina nel mondo batterico. I batteri dell’acido lattico nella flora endogena delle carni fermentate come le salsicce sono riconosciuti come i maggiori produttori di tiramina. I formaggi e alcuni prodotti a base di carne possono essere substrati adatti alla produzione di 2-feniletilamina, tiramina, istidina o altre ammine. Questi ceppi ospitano quindi geni o operoni che codificano le decarbossilasi o altri enzimi coinvolti nella sintesi delle ammine biogene o nel loro catabolismo. Per i prodotti del mare, la sintesi delle ammine biogene non è attribuita agli enterococchi. Mentre i batteri resistenti al calore come gli enterococchi, che sono i principali batteri coinvolti nella produzione di ammine biogene nei prodotti lattiero-caseari, sono solo parzialmente eliminati dalla pastorizzazione, il trattamento termico riduce il livello di ammine biogene. Questo fenomeno può essere dovuto alla diminuzione del livello di contaminazione dell’alimento e/o al fatto che un cofattore essenziale di decarbossilazione è stato denaturato dalla pastorizzazione.

Anche se i batteri lattici non sono molto attivi verso i lipidi, sono noti per partecipare all’aromatizzazione dei formaggi, sia attraverso la conversione degli acidi grassi a catena corta in chetoni o lattoni metilati, sia attraverso la formazione di aldeidi derivanti dall’ossidazione degli acidi grassi insaturi e responsabili dello sviluppo di odori e sapori rancidi, sia attraverso la solvatazione dei composti aromatici prodotti dai lipidi ma anche dalle proteine e dal lattosio. Secondo , e , gli enterococchi hanno attività di esterasi che sono spesso più forti di altri batteri lattici. Tra gli enterococchi, queste attività sono anche variabili e le ricerche mostrano che sono più forti in E. faecalis che in E. faecium. Altri studi mostrano che l’attività lipolitica degli enterococchi varia non secondo la specie, ma secondo il tipo di formaggio da cui il ceppo proviene.

Già nel 1965, ha mostrato attività di esterasi espresse da ceppi di E. faecalis e E. faecium. mostrano che gli enterococchi erano più attivi sui trigliceridi rispetto ai ceppi di Streptococcus e che i tassi di idrolisi diminuivano all’aumentare della lunghezza della catena di carbonio degli acidi grassi liberati (tripropionina > tributirina > tricaprina > tricaprylin). Essi evidenziano la mancanza di attività sulla trioleina. mostrano che gli enterococchi mostrano una bassa attività lipolitica quando sono posti in un mezzo di crescita contenente latte intero. Il lavoro di mostra l’idrolisi della tributirina espressa da E. faecium ed E. faecal è isolato dal formaggio, tuttavia questi ceppi non sono attivi sui lipidi del latte. mostrano che una lipasi di E. faecalis è anche più attiva sulla tributirina che sulla tricaproina, tricaprylin e trioleina. Tuttavia, secondo , la capacità degli enterococchi di idrolizzare i lipidi del latte è molto variabile da un ceppo all’altro. Alcuni ceppi non mostrano alcuna attività lipolitica, mentre altri mostrano un’elevata attività su una vasta gamma di acidi grassi. Il lavoro di , realizzato su substrati sintetici (4-nitrofenil-acetati), mostra l’attività di E. faecium su acidi grassi la cui lunghezza della catena è compresa tra 2 e 18 carboni. In studi successivi, questi stessi autori mostrano che un’esterasi intracellulare di E. faecium sviluppa, in vitro, un’attività su 4-nitrofenil-acili la cui lunghezza della catena è compresa tra 2 e 12 carboni, con un optimum in presenza di 4-nitrofenil-butirrato (C2). Il lavoro dimostra che la maggior parte dei ceppi di enterococchi testati (90%, N = 129), sono in grado di idrolizzare trigliceridi omogenei contenenti acidi grassi con una lunghezza della catena tra 4 e 18 carboni, l’attività diminuisce con l’aumentare della lunghezza della catena di carbonio. Tutti i ceppi testati (100%) in questo stesso studio mostrano un’attività sui substrati sintetici, dal 4-nitrofenilacetato (C2) al 4-nitrofenilstearato (C18), con un’attività che si riduce all’aumentare della lunghezza della catena di carbonio dell’acido grasso.

Tra i pochi studi pubblicati sulle attività idrolitiche che possono essere coinvolte nel deterioramento dei prodotti a base di uova ci sono quelli che mostrano attività lipolitiche espresse dai ceppi E. faecium e in particolare E. faecalis isolati da prodotti a base di uova intere liquide pastorizzate rovinate. Lavoro da rivelare che le attività di lipasi sono rilevate anche per la metà dei ceppi di Enterococcus derivati da albume industriale e testato per la loro capacità di rovinare uno dei componenti principali dei dessert isola galleggiante, la crema pasticcera.