Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology

I rivestimenti delle spore sono composti da proteine, hanno matrici ordinate di subunità protomeriche, mostrano auto-assemblaggio e hanno proprietà protettive. Come forme di vita dormienti metabolicamente inattive, le spore possono sopravvivere indefinitamente in uno stato essiccato, e infatti sono state documentate come sopravvivere intatte per milioni di anni. La spora può resistere a temperature fino a 90°C e all’esposizione a sostanze chimiche nocive. La maggior parte (ma non tutti) i batteri che formano spore appartengono a due generi principali, Bacillus e Clostridium. Le specie di Bacillus producono una singola spora o endospora (a differenza delle esospore dei funghi) all’interno della cellula batterica attraverso un processo di differenziazione che richiede l’azione coordinata di centinaia di geni di sviluppo. In genere le spore mature sono 0,8-1,2 μm di lunghezza e hanno una forma sferica o ellissoidale (vedi Figura 1A). Il singolo cromosoma batterico è condensato all’interno del centro della spora noto come nucleo. Strati di membrana lipidica e peptidoglicano modificato circondano il nucleo della spora, ma la struttura più importante è il mantello della spora. Questo guscio proteico laminato fornisce alla spora la resistenza ai solventi organici e al lisozima. Nel Bacillus subtilis sono presenti fino a 25 diverse proteine del mantello in due strati distinti (Figura 1B), il mantello interno ed esterno, ma in altre specie è dimostrato che il mantello è meno complesso e in alcuni casi può consistere solo di pochi tipi di proteine. La struttura e l’assemblaggio del mantello della spora sta ora emergendo come un sistema modello per comprendere i complessi processi di assemblaggio morfogenetico simile ai classici studi sull’assemblaggio del fago T4. Lo strato esterno, denso di elettroni, del mantello di B. subtilis è composto da 5 polipeptidi principali, CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) e CotF (8 kDa). CotA è un’ossidasi multi-rame e può accumularsi in forme multimeriche (osservate al microscopio) all’interno delle cellule sporulanti in alcuni mutanti con difetti di rivestimento. Presumibilmente l’oligomerizzazione e l’autoassemblaggio di CotA precede la deposizione sulla superficie del mantello della spora. Le proteine CotG e CotB hanno anche dimostrato di interagire covalentemente e inoltre CotG e anche CotC hanno sequenze aminoacidiche estremamente insolite contenenti ripetizioni multiple (>13) di 12-13 aminoacidi ricchi di lisine e tirosine. Inoltre, molte delle proteine del mantello della spora hanno profili insoliti, cioè forme multimeriche e masse molecolari aberranti, quando esaminate tramite SDS-PAGE. Recentemente, è stato dimostrato che il mantello della spora è effettivamente flessibile e può espandersi e contrarsi e questa caratteristica è fondamentale per la formazione della spora quando la spora si disidrata e allo stesso modo per la germinazione quando la spora si reidrata. Questo aspetto di una struttura auto-assemblata è particolarmente interessante e potrebbe offrire una serie di applicazioni future nella somministrazione di farmaci, nella nanofabbricazione e nei rivestimenti di superficie.

Le endospore batteriche. Il pannello A mostra le endospore di B. subtilis, una delle quali è ancora trattenuta all’interno della “cellula madre” a forma di asta. In B. subtilis, le spore sono lunghe circa 1,2 μm e sono ellissoidali. Le spore rilasciate hanno un chiaro guscio protettivo conosciuto come il mantello della spora ed è composto da ben 25 diversi componenti protomerici assemblati in strati discreti. Il pannello B mostra un tipico frazionamento SDS-PAGE (12,5%) delle proteine del mantello della spora solubilizzate che rivela le specie predominanti.

Engineering the Bacterial Spore Coat

Una strategia per ingegnerizzare le spore di Bacillus subtilis per visualizzare antigeni eterologhi sulla superficie della spora è stata recentemente riportata ed è illustrata nella Figura 2. Un sistema di visualizzazione basato sulle spore offre diversi vantaggi rispetto ai sistemi basati sull’uso di cellule batteriche, questi includono la robustezza della spora batterica che permette la conservazione in forma essiccata, la facilità di produzione, la sicurezza e una piattaforma tecnologica supportata da ampi strumenti per la manipolazione genetica.

Visualizzazione della superficie delle spore utilizzando proteine del mantello delle spore. La spora di B. subtilis è composta da un nucleo interno (giallo) circondato da una corteccia simile al peptidoglicano (in rosso) e da un mantello proteico suddiviso in una parte interna (verde) e una esterna (nero). La proteina di fusione, composta da una parte portante (blu) e una parte passeggera (viola) è esposta sulla superficie della spora.

In contrasto con la ricchezza di informazioni disponibili su come l’espressione genica controlla la differenziazione di una cellula in crescita in una spora dormiente poco si sa sui meccanismi di incorporazione delle proteine nel mantello, sulla natura dei componenti strutturali che formano la parte più esterna del mantello e se ci sono motivi di ancoraggio. I primi tentativi di esporre proteine eterologhe sulla superficie della spora si sono concentrati su due componenti del mantello, CotB e CotC. Nel caso di CotB questa proteina del mantello della spora è nota per essere localizzata in superficie mentre per CotC, rispetto ad altre proteine del mantello, questa specie ha un’alta abbondanza relativa. L’osservazione che entrambi questi componenti del mantello erano dispensabili per la formazione di una spora apparentemente normale così come per la sua germinazione, è stata un’ulteriore caratteristica positiva nella scelta di CotB e CotC come potenziali proteine del mantello.

Due antigeni sono stati inizialmente selezionati come proteine modello da visualizzare sulla superficie della spora: i) il frammento C-terminale non tossico di 459 aminoacidi della tossina tetanica (TTFC), un peptide ben caratterizzato e altamente immunogenico di 51.8 kDa, codificato dal gene tetC di Clostridium tetani; e ii) la subunità B di 103 aminoacidi della tossina termolabile dei ceppi enterotossigeni di Escherichia coli (LTB), un peptide di 12 kDa, codificato dal gene eltB.

CotB come proteina carrier

Come altri componenti del mantello, CotB è stata associata allo strato esterno del mantello sulla base di prove genetiche e solo recentemente un’analisi immunocitofluorimetrica eseguita su spore intatte ha dimostrato che CotB è accessibile agli anticorpi specifici di CotB e quindi che molto probabilmente è esposta sulla superficie della spora .

Il gene strutturale CotB, cotB, è sotto il doppio controllo trascrizionale di σK e della proteina GerE che lega il DNA. Di conseguenza, cotB è trascritto solo nel compartimento della cellula madre della cellula sporulante. Una volta sintetizzato nel citoplasma della cellula madre, CotB viene assemblato intorno alla spora in formazione in un modo in qualche modo dipendente da CotE, CotG e CotH. Pertanto, CotB e la proteina eterologa eventualmente fusa ad essa, non subiscono una fase di traslocazione della parete cellulare, tipica dei sistemi di visualizzazione in altri batteri.

CotB ha una metà C-terminale fortemente idrofila formata da tre 27 aminoacidi ripetuti ricchi di residui di serina, lisina e glutamina. I residui di serina rappresentano oltre il 50% della metà C-terminale di CotB. I residui di lisina nelle ripetizioni di CotB sono stati suggeriti per rappresentare siti di reticolazione intra- o inter-molecolare, per analogia con le proteine del tessuto connettivo collagene ed elastina. La proteina CotB ha una massa molecolare dedotta di 46 kDa, ma migra su SDS-PAGE come un polipeptide di 59 kDa. Recentemente la discrepanza tra il peso molecolare misurato e quello dedotto è stata spiegata mostrando che CotB è inizialmente sintetizzata come una specie di 46 kDa, e convertita in un omodimero di 59 kDa, che mantiene entrambe le estremità N e C-terminali previste dalla sequenza nucleotidica di CotB.

La strategia per ottenere spore ricombinanti B. subtilis spore che esprimono CotB-TTFC o CotB-LTB sulla loro superficie era basata su (i) l’uso del gene cotB e del suo promotore per la costruzione di fusioni traslazionali e (ii) l’integrazione cromosomica delle fusioni dei geni cotB-tetC e cotB-eltB nella sequenza codificante del gene non essenziale amyE (Figura 3A) . Posizionando le proteine di fusione sotto i segnali trascrizionali e traslazionali di cotB si è assicurata la corretta tempistica di espressione durante la sporulazione, mentre la sua integrazione cromosomica ha garantito la stabilità genetica del costrutto. A causa della mancanza di informazioni sull’assemblaggio del mantello di CotB e sui requisiti dei motivi di ancoraggio, i tentativi iniziali sono stati eseguiti posizionando la proteina passeggero al C-terminale, all’N-terminale o al centro di CotB (Fig. 3B).

Sistema di visualizzazione su superficie di spora in B. subtilis . (A) Vista schematica dell’integrazione delle fusioni geniche sul cromosoma. Le barre rosse rappresentano la fusione genica, le barre grigie e verdi rappresentano rispettivamente il gene amyE non essenziale di B. subtilis usato come sito di integrazione e il gene cloramfenicolo acetil transferasi (cat) usato come marcatore selezionabile. (B) Rappresentazione schematica delle proteine di fusione utilizzando CotB a lunghezza intera (380 aminoacidi) o CotBΔ105 (275 aminoacidi) o CotC (66 aminoacidi) come proteine carrier (tutte in blu). Le tre ripetizioni di 27 aminoacidi di CotB a lunghezza intera e la parte di esse che rimane in CotBΔ105 sono in nero. Le barre viola rappresentano la parte eterologa delle fusioni (TTFC o LTB).

Quando TTFC e LTB sono stati fusi all’estremità C-terminale di CotB, le proteine chimeriche non sono riuscite ad assemblarsi correttamente sulla superficie della spora (Isticato e Ricca, non pubblicato). Tali fallimenti iniziali sono stati attribuiti a una potenziale instabilità dei costrutti, sia a livello di DNA (sequenze di DNA ripetitive) che a livello proteico. Per aggirare tali problemi, TTFC e LTB sono stati fusi all’estremità C-terminale di una forma di CotB eliminata delle tre ripetizioni di 27 aminoacidi, CotBΔ105-TTFC (Fig. 3A). In contrasto con la versione completa, la proteina chimerica CotBΔ105-TTFC era correttamente assemblata ed esposta sulla superficie della spora. Un dot blot quantitativo ha mostrato che ogni spora ricombinante ha esposto una quantità di proteina di fusione CotBΔ105-TTFC pari a 0,00022 pg, rendendo possibile concludere che 1,5 × 103 molecole chimeriche sono presenti sulla superficie di ogni spora ricombinante. Il ceppo che esprime questa chimera ha mostrato una ridotta efficienza di sporulazione e germinazione e le sue spore non erano resistenti al lisozima. Queste osservazioni, insieme all’analisi SDS-PAGE delle proteine del mantello rilasciate, hanno suggerito che la presenza di CotBΔ105-LTB ha fortemente alterato lo strato del mantello delle spore. Un’analisi in silico ha mostrato una certa omologia tra il prodotto chimerico (nella regione di fusione) e LytF, un’endopeptidasi associata alla parete cellulare prodotta da B. subtilis durante la crescita vegetativa, sollevando così la possibilità che il prodotto chimerico possa interferire con la corretta formazione del mantello degradando alcuni componenti del mantello (Mauriello e Ricca, dati non mostrati).

Oltre alla fusione dell’estremità C-terminale descritta sopra, la proteina passeggero modello TTFC è stata fusa anche all’N-terminale e al centro di CotB (Fig. 3B). In entrambi i casi è stata usata la forma CotBΔ105 di CotB per evitare i problemi incontrati con la fusione C-terminale (vedi sopra). Sia la fusione N-terminale che quella a sandwich hanno dato origine a prodotti chimerici che erano correttamente assemblati nella struttura del mantello sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo. Almeno nel caso di CotB, è stato quindi possibile concludere che laddove la proteina passeggera è esposta non influisce sulla visualizzazione sulla superficie della spora.

CotC come proteina carrier

CotC è un componente solubile in alcali di 12 kDa del mantello della spora di B. subtilis, precedentemente identificato dalla genetica inversa e poi associato allo strato esterno del mantello in base a prove genetiche. CotC è stato inizialmente considerato come un candidato portatore a causa della sua abbondanza relativa nel cappotto (Figura 1B). Insieme a CotG e CotD, CotC rappresenta circa il 50% del totale delle proteine del mantello solubilizzate. Tali quantità relativamente elevate potrebbero consentire l’assemblaggio di un numero significativo di chimere basate su CotC sul mantello, garantendo così un efficiente display eterologo. L’espressione del gene CotC è sotto il controllo del fattore σ σK specifico della cellula madre e dei regolatori trascrizionali GerE e SpoIIID. Come nel caso di CotB, anche CotC viene trascritto nella cellula madre e il suo assemblaggio sul mantello non richiede la traslocazione sulla membrana. Il prodotto primario del gene CotC è un polipeptide di 66 aminoacidi estremamente ricco di residui di tirosina (30,3%) e lisina (28,8%). Tuttavia, è stato recentemente dimostrato che CotC è assemblato in almeno quattro forme proteiche distinte, di dimensioni comprese tra 12 e 30 kDa. Due di queste, con masse molecolari di 12 e 21 kDa e corrispondenti molto probabilmente a una forma monomerica e omodimerica di CotC rispettivamente, sono assemblate sulla spora in formazione subito dopo la loro sintesi otto ore dopo l’inizio della sporulazione. Le altre due forme, 12,5 e 30 kDa, sono probabilmente i prodotti di modifiche post-traslazionali delle altre due forme, che avvengono direttamente sulla superficie del mantello durante la maturazione della spora.

Nel caso di CotC sono state finora costruite solo fusioni C-terminali (Figura 3B). Entrambe le fusioni geniche CotC-TTFC e CotC-LTB sono state ottenute clonando tetC o eltB in frame con l’ultimo codone di CotC sotto il controllo trascrizionale e traslazionale della regione promotrice di CotC. La fusione genica è stata poi integrata nel cromosoma di B. subtilis al locus amyE tramite ricombinazione a doppio cross-over (Figura 3A). Entrambe queste due proteine chimeriche sono state assemblate sul mantello delle spore ricombinanti senza grandi effetti sulla struttura della spora e/o sulla funzione, poiché sono apparse identiche alle spore di tipo selvatico in termini di efficienza di sporulazione e germinazione e proprietà di resistenza. Il Western blot, l’analisi citofluorimetrica e, per CotC-TTFC, la microscopia a immunofluorescenza (Figura 4) hanno mostrato che entrambe le chimere a base di CotC erano visualizzate sulla superficie delle spore ricombinanti. Una determinazione quantitativa delle proteine ricombinanti esposte sulle spore di B. subtilis ha rivelato che ca. 9,7 × 102 e 2,7 × 103 molecole di CotC-TTFC e CotC-LTB, rispettivamente, sono state estratte da ogni spora.

Rilevazione della presenza di CotC-LTB e CotC-TTFC mediante microscopia a immunofluorescenza. La sporulazione dei ceppi di B. subtilis è stata indotta con il metodo della risospensione, e i campioni sono stati prelevati 6 ore dopo l’inizio della sporulazione e analizzati mediante microscopia a immunofluorescenza come descritto in precedenza. I campioni sono stati etichettati con anticorpo di topo anti-LTB seguito da coniugato anti-mouse IgG-TRITC (rosso fluoresceina, pannelli A & B), o anticorpo di coniglio anti-TTFC seguito da coniugato anti-rabbit IgG-FITC (verde fluoresceina, pannelli C & D). Pannelli A & C, spore wild type; Pannello B, spore isogeniche che esprimono CotC-LTB); Pannello D, spore isogeniche che esprimono CotC-TTFC.

Anche se CotC sembra più abbondante di CotB all’interno del cappotto, quantità comparabili di proteine eterologhe sono esposte dal CotC-based e il CotBΔ105-based sistemi. Questo risultato era in qualche modo inaspettato, poiché CotC sembra essere molto più abbondante di CotB nel mantello. Una possibile spiegazione viene dalla recente scoperta che l’estremità C-terminale di CotC non è solo essenziale per l’interazione con altre molecole CotC ma anche con altri componenti del mantello (Isticato e Ricca, manoscritto in preparazione) e quindi mostra che l’uso di CotC come vettore deve ancora essere ottimizzato.

Stabilità delle proteine esposte nelle spore

Una delle ragioni principali per proporre l’uso della spora batterica come sistema di esposizione favorevole è la sua ben documentata stabilità. Le spore possono essere semplicemente conservate a temperatura ambiente per un lungo periodo di tempo senza riduzione delle loro proprietà di resistenza e stabilità. Questa sarebbe una proprietà estremamente utile per una varietà di applicazioni biotecnologiche. Per esempio, se la proteina passeggera è un antigene, la spora ricombinante potrebbe diventare un vaccino orale stabile al calore ideale per l’uso nei paesi in via di sviluppo, dove la stabilità al calore è di maggiore preoccupazione a causa della scarsa distribuzione e conservazione.

Tuttavia, mentre la stabilità della spora è ben documentata, la stabilità delle proteine eterologhe esposte sulla superficie della spora è stata studiata solo recentemente. Le spore che esprimono CotBΔ105-TTFC (vedi sopra) e le spore parentali sono state conservate a -80°C, -20°C, +4°C e a temperatura ambiente e analizzate in diversi tempi di conservazione fino a 12 settimane. In tutti i casi la quantità di proteina eterologa presente sulla superficie delle spore ricombinanti è apparsa identica tra le spore appena preparate e quelle conservate fino a 12 settimane (Fig. 5). Questi risultati, che indicano che le proteine eterologhe possono essere esposte in modo stabile sulla superficie delle spore ricombinanti, confermano il sistema basato sulle spore come un approccio di visualizzazione molto promettente che potrebbe superare alcuni svantaggi di altri sistemi e che potrebbe trovare applicazioni in una varietà di campi biotecnologici diversi.

Analisi delle proteine estratte dalle spore wild-type e dalle spore che esprimono la chimera CotBΔ 105 -TTFC. Spore appena purificate che esprimono la chimera CotBΔ105-TTFC (t0) o dopo 4, 8 o 12 settimane (t4, t8 e t12) di conservazione a temperatura ambiente sono state esaminate mediante dot blotting delle proteine del mantello delle spore estratte. Le concentrazioni di TTFC purificate (in nanogrammi) e di proteine del mantello (in microgrammi) sono indicate. Le proteine sono state caricate e fatte reagire con anticorpi monoclonali anti-TTFC (Boeringher), poi con anticorpi secondari coniugati alla fosfatasi. Segnali di intensità simile sono stati ottenuti con spore appena purificate e spore conservate a temperatura ambiente fino a 12 settimane.

Prova di principio per la vaccinazione orale utilizzando il tetano come malattia modello

Le spore che esprimono CotBΔ105-TTFC sono state utilizzate per immunizzare topi per via orale. Le IgG del siero e le sIgA fecali hanno mostrato una chiara sieroconversione al TTFC. Il programma di dosaggio ha utilizzato tre serie di tre dosi (1,67 × 1010) in 5 settimane e si è basato su regimi ottimizzati per le immunizzazioni orali. I titoli di IgG specifiche al TTFC dopo 33 giorni (>103) hanno suggerito che questi erano a livelli protettivi e i topi sfidati con la tossina tetanica corrispondente a 10 LD50 erano completamente protetti. Su otto topi sfidati con una dose di 20 LD50, sette sono sopravvissuti, suggerendo che questa era la soglia per la protezione. Uno studio simile è stato fatto utilizzando l’immunizzazione nasale con spore CotB-TTFC, ma con una dose inferiore e tre immunizzazioni. Qui, le risposte IgG specifiche del TTFC erano più basse ma mostravano ancora la sieroconversione. Questi studi dimostrano che le spore ingegnerizzate che esprimono un antigene eterologo possono essere utilizzate per l’immunizzazione protettiva. Inoltre, anche se le risposte mucosali non sono importanti per la protezione contro Clostridium tetani (un patogeno sistemico) sono ovviamente importanti per i patogeni delle mucose. Saranno necessari ulteriori studi per ottimizzare i regimi di dosaggio (meno dosi e meno spore), ma questi studi seminali hanno aperto la strada allo sviluppo contro patogeni specifici delle mucose. Anche se questi studi sono incoraggianti e dimostrano risposte umorali, non ci sono ancora prove chiare che indichino risposte cellulari. Tuttavia, è stato dimostrato che le spore si diffondono nel GALT e si trovano nel Peyer’s Patches (PP) e nei linfonodi mesenterici. Le piccole dimensioni della spora (1 μm) le permetterebbero di essere assorbite dalle cellule M e trasportate nei PP dove potrebbero interagire con le cellule che presentano l’antigene. Gli studi iniziali hanno dimostrato che le spore possono germinare e persistere per un breve periodo di tempo all’interno dei macrofagi intestinali, nonché suscitare citochine Th 1 in vivo come IFN-γ.