Cos’è la spettroscopia di fluorescenza?

Cos’è uno spettro di fluorescenza?

Fig. 1: Uno spettro di eccitazione della fluorescenza (blu) e uno spettro di emissione (viola) sono immagini speculari l’uno dell’altro

Lo spettro di fluorescenza allo stato stazionario si ha quando le molecole, eccitate da una fonte di luce costante, emettono fluorescenza e i fotoni emessi, o intensità, sono rilevati in funzione della lunghezza d’onda. Uno spettro di emissione di fluorescenza si ha quando la lunghezza d’onda di eccitazione è fissa e la lunghezza d’onda di emissione viene scansionata per ottenere un grafico dell’intensità rispetto alla lunghezza d’onda di emissione.

Uno spettro di eccitazione di fluorescenza si ha quando la lunghezza d’onda di emissione è fissa e la lunghezza d’onda del monocromatore di eccitazione viene scansionata. In questo modo, lo spettro fornisce informazioni sulle lunghezze d’onda alle quali un campione assorbirà in modo da emettere alla singola lunghezza d’onda di emissione scelta per l’osservazione. È analogo allo spettro di assorbanza, ma è una tecnica molto più sensibile in termini di limiti di rilevamento e specificità molecolare. Gli spettri di eccitazione sono specifici per una singola lunghezza d’onda/specie emittente, al contrario di uno spettro di assorbanza, che misura tutte le specie assorbenti in una soluzione o campione. Gli spettri di emissione e di eccitazione per un dato fluoroforo sono immagini speculari l’uno dell’altro. Tipicamente, lo spettro di emissione si verifica a lunghezze d’onda più alte (energia inferiore) rispetto allo spettro di eccitazione o di assorbanza.

Questi due tipi di spettro (emissione ed eccitazione) sono usati per vedere come sta cambiando un campione. L’intensità spettrale e o la lunghezza d’onda del picco possono cambiare con varianti come la temperatura, la concentrazione o le interazioni con altre molecole intorno. Questo include molecole quencher e molecole o materiali che coinvolgono il trasferimento di energia. Alcuni fluorofori sono anche sensibili alle proprietà dell’ambiente del solvente come il pH, la polarità e certe concentrazioni di ioni.