Come faccio a sapere se l’anticorpo avrà una reazione incrociata?

La cross-reattività si verifica quando un anticorpo cresciuto contro un antigene specifico riconosce due antigeni che hanno regioni strutturali simili.

Che cos’è la cross-reattività?

Un anticorpo ha una specifica sequenza di aminoacidi (la regione Fab) che detta la sua affinità per un antigene specifico. La reattività incrociata tra antigeni si verifica quando un anticorpo cresciuto contro un antigene specifico ha un’alta affinità concorrente verso un antigene diverso. Questo è spesso il caso quando due antigeni hanno regioni strutturali simili che l’anticorpo riconosce.

La reattività incrociata può invalidare i risultati di un esperimento e quindi incidere sulla riproducibilità scientifica. Quindi, testare un anticorpo per la cross-reattività con proteine strettamente correlate è un esperimento di validazione critico.

Come si controlla la cross-reattività?

La cross-reattività non è sempre una qualità negativa. A volte può migliorare l’utilità di un anticorpo. Per esempio, la cross-reattività di un anticorpo per un bersaglio attraverso le specie permette allo stesso anticorpo di essere usato in più organismi modello.

La cross-reattività attraverso le specie si verifica spesso per gli anticorpi derivati da antigeni umani. Molti anticorpi umani nel catalogo Proteintech hanno una significativa cross-reattività con le proteine omologhe in modelli non umani, come il topo, il ratto, la scimmia o il pesce zebra.

Sulla base dell’omologia di una sequenza proteica e delle pubblicazioni che utilizzano i nostri anticorpi in organismi non umani, molti degli anticorpi Proteintech possono essere utilizzati non solo per campioni umani, ma anche per una varietà di organismi. L’omologia può essere valutata usando un allineamento di sequenza a coppie tra l’immunogeno e l’antigene bersaglio attraverso il sito NCBI-BLAST, e ulteriori informazioni possono essere controllate sul sito web UniProt Universal Protein resource.

Qual è il “numero giusto” di omologia per prevedere la cross-reattività?

Sulla base della nostra esperienza, se l’immunogeno e la sequenza della potenziale proteina cross-reattiva condividono il 75% di omologia di sequenza, si prevede la cross-reattività. Se il tuo campione non è umano, si raccomanda un policlonale perché c’è una miscela di epitopi riconosciuti.

Il mio anticorpo reagisce in modo incrociato con altre specie?

Dipende dal grado di similarità della sequenza proteica tra l’immunogeno e la sequenza della potenziale proteina cross-reattiva.

Come evitare la cross-reattività nel western blot

Se possibile, si raccomanda di usare l’anticorpo secondario specifico al primo anticorpo usato; per esempio, se l’anticorpo primario è di topo, allora l’anticorpo secondario dovrebbe essere anti-mouse IgG-HRP. Nel caso in cui l’anticorpo secondario sia policlonale e generato contro l’intera molecola IgG, allora l’anticorpo di coniglio che riconosce l’Ab primario di topo potrebbe non essere la scelta migliore a causa del riconoscimento della regione comune della catena leggera Kappa.

Come evitare la reattività incrociata durante gli esperimenti di immunocolorazione

La reattività incrociata potrebbe verificarsi nei saggi di immunocolorazione utilizzando campioni derivati da tessuti; pertanto, è comune utilizzare frammenti, piuttosto che intere IgG, come immunoglobuline primarie (per esempio, quando si lavora con anticorpi di topo su tessuti di topo). Inoltre, mentre si fa una colorazione multipla, per assicurarsi che non ci sia una reazione incrociata, cercare di usare diversi anticorpi secondari, per esempio, 568 coniglio anti-capra con un 488 coniglio anti-mouse, che sono abbastanza comuni e facili da trovare.

Che cos’è il cross-adsorbimento dell’anticorpo secondario e la cross-reattività?

Gli anticorpi secondari cross-adsorbiti sono quegli anticorpi policlonali che vengono prodotti con un ulteriore passaggio di purificazione per filtrare i membri che si legano a specie di immunoglobuline (IgG) fuori bersaglio. Questo processo può diminuire la cross-reattività di specie e aumentare la specificità. A seconda dell’impostazione dell’esperimento ci sono varietà di anticorpi secondari cross-adsorbed e altamente cross-adsorbed.

1. Anticorpi policlonali vs. monoclonali

2. Selezione degli anticorpi secondari

3. Antigene proteico o peptidico? Vantaggi e svantaggi

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