Apoenzima

5.11.3 Ruolo della proteina-Interazioni tra enzima, coenzima e substrato

In tutti i casi, il coenzima è legato all’apoenzima senza un profondo cambiamento nello spettro di assorbimento. Questa osservazione suggerisce che l’enzima non distorce l’anello di corrina dalla sua conformazione in soluzione allo stato fondamentale. Tuttavia, nessuna informazione sull’identità del ligando α-assiale è disponibile dallo spettro di assorbimento UV-visibile del complesso coenzima-proteina. Gli studi hanno dimostrato che il ligando α-assiale 5,6-dimetilbenzimidazolo è sostituito da una catena laterale di istidina della rispettiva proteina in almeno tre enzimi cobalamina-dipendenti: metionina sintasi,4,7 metilmalonil-CoA mutasi,8,45,46 e glutammato mutasi.47 Al contrario, il ligando 5,6-benzimidazolo della cobalamina occupa ancora la posizione di ligando α-assiale in AdoCbl legato alla diolo deidrasi48 e alla ribonucleotide reduttasi (vedi capitolo 5.08).

Per ospitare la coordinazione da parte della catena laterale dell’istidina, il “loop nucleotidico” della base 5,6-dimetilbenzimidazolo, il ribofuranosilfosfodiestere, e la catena laterale propionamide devono oscillare lontano dall’anello corrinico e inserirsi in una tasca di legame all’interno della proteina. La sequenza di consenso DxHxxG è stata identificata in enzimi cobalamina-dipendenti che sostituiscono una catena laterale di istidina per il ligando α-assiale.7,49,50 L’istidina che si coordina all’atomo di cobalto interagisce quasi certamente con il residuo di aspartato attraverso un legame idrogeno. Oltre al ruolo di un ligando di coordinamento, l’esatta funzione della diade His/Asp come modulatore dell’attività enzimatica non è ancora chiara.49 Altri residui nel sito attivo possono anche partecipare a una rete estesa di legami a idrogeno per controllare la reattività al centro metallico.7

Gli enzimi adenosilcobalamina-dipendenti devono aumentare il tasso di omolisi del legame CoC di almeno un fattore 1012 per raggiungere il tasso di catalisi osservato.14 La labilizzazione dell’adenosilcobalamina richiede un indebolimento del legame CoC per permettere la fissione omolitica. Sebbene non sia un concetto provato negli enzimi cobalamina-dipendenti, l’energia sufficiente per distorcere (indebolire) il legame CoC potrebbe facilmente provenire dall’utilizzo dell’energia di legame in eccesso che deriva da interazioni multiple di legame a idrogeno con il cofattore cobalamina, comprese le catene laterali ammidiche che decorano l’anello corrin.51 Le catene laterali ammidiche sono anche importanti elementi di riconoscimento per il legame alle proteine di trasporto nonenzimatico della cobalamina transcobalamina, aptocorrin e fattore intrinseco.52 La rimozione o la derivatizzazione chimica di specifiche catene laterali amidiche altera il legame alla transcobalamina di 3-40 volte52 e la rimozione completa della catena laterale c-amidica permette l’introduzione di un doppio legame aggiuntivo nello scheletro macrociclico, appiattendo così l’anello corrinico con un conseguente spostamento in rosso del massimo di assorbimento.53

Oltre a promuovere la reazione desiderata, gli enzimi adenosilcobalamina-dipendenti svolgono una seconda importante funzione prevenendo le reazioni collaterali indesiderate che spesso accompagnano le reazioni radicali.54 Questa funzione di catalisi negativa54 richiede una superficie di energia libera altamente vincolata che potrebbe essere immaginata come un profondo canyon attraverso il quale la reazione procede lungo la superficie di energia libera. Questo canyon deve avere pareti ripide per prevenire reazioni collaterali e vincolare l’intermedio radicale altamente reattivo. Alla fine della sequenza di reazione, l’intermedio radicale viene spento dalla ricombinazione del radicale 5′-deossiadenosile e del cob(II)alamina, rigenerando così lo stato fondamentale (stato di riposo) del cofattore adenosilcob(III)alamina. Se l’enzima investe 25 kcal mol-1 per promuovere l’omolisi del legame C-Co per iniziare il ciclo catalitico, questa energia deve essere recuperata alla fine della sequenza di reazione. Il recupero dell’energia non sarebbe possibile se si verificasse una sequenza indesiderata di riarrangiamenti per produrre un radicale che è termodinamicamente più stabile del radicale 5′-deossiadenosile. Pertanto, l’enzima deve impedire che il radicale alchilico si riarrangi in un intermedio a bassa energia, o che migri attraverso l’impalcatura proteica per formare un radicale stabile che non può partecipare alla catalisi.55

Una specie paramagnetica non si forma finché tutti i componenti di reazione sono presenti nel complesso enzima-substrato, poiché la formazione di un radicale derivato dal coenzima in assenza di substrato potrebbe portare a reazioni collaterali indesiderate. Esperimenti EPR con la metilmalonil-CoA mutasi46,55 confermano che l’omolisi del legame CoC avviene solo dopo l’aggiunta del substrato, come indicato dalla comparsa di un segnale EPR simile al prodotto.46 Analogamente, esperimenti spettrofotometrici a flusso fermato con l’etanolamina ammoniaca liasi mostrano che la firma del cob(II)alamina appare nello spettro visibile solo dopo che l’enzima e il coenzima sono combinati con livelli saturanti di substrato.56-59

Fotolisi, termolisi e omolisi promossa dall’enzima del legame CoC dell’adeno-silcobalamina danno luogo alla coppia di radicali singoletto costituita da cob(II)alamina e dal radicale 5′-deossiadenosile.60,61 Poiché tutti questi processi portano alla formazione della stessa coppia di radicali, le informazioni dalla dinamica di reazione degli studi di fotolisi possono essere messe in relazione con i meccanismi di reazione enzimatica proposti. La fotoomolisi dell’adenosilcobalamina inizia con una promozione elettronica π → π* nell’anello corrinico e deve coinvolgere uno stato intermedio di trasferimento di carica sulla via dell’omolisi del legame CoC.60,61 Studi di fotolisi a picosecondi dell’adenosilcobalamina rivelano tassi di ricombinazione delle coppie di radicali geminati di 109 s-1, con efficienze di ricombinazione frazionaria della gabbia, Fc, di circa il 94%.42,62-64 Studi di fotolisi a nanosecondi e in onda continua delle cobalamine confermano un’efficiente ricombinazione delle coppie di radicali nella gabbia geminata, con un rendimento quantico fotochimico complessivo di circa il 20% per l’adenosilcobalamina e del 35% per la metilcobalamina.65,66 In assenza di enzima, una grande frazione delle coppie di radicali geminati si ricombina prima che avvenga una significativa separazione diffusionale. Per stabilizzare il radicale 5′-deossiadenosile e promuovere la catalisi, l’enzima deve aumentare la distanza di separazione delle coppie di radicali, probabilmente attraverso un cambiamento conformazionale. Qualunque sia il meccanismo, l’alto tasso di ricombinazione del geminato nella coppia di radicali richiede che una delle funzioni dell’enzima sia quella di separare i radicali o intrappolare temporaneamente uno dei radicali per prevenire la ricombinazione prematura.

Anche se le coppie di radicali singoletto {5′-deossiadenosile:cob(II)alamina} risultanti hanno stati elettronici identici,59-61,67 l’omolisi enzimatica del legame CoC non può accedere a uno stato elettronico eccitato e deve iniziare con un altro processo per indebolire il legame CoC e spostare l’equilibrio verso la dissociazione (vedi sezione 5.11.2). La scissione indotta dalla tensione non solo porterà all’omolisi del legame CoC, ma questo processo aumenterà anche la distanza di separazione delle coppie radicali se una componente della distorsione avviene lungo l’asse apicale del cobalto. Questo approccio a forza bruta di allungare il legame CoC può essere il metodo più efficiente per ottenere sia l’omolisi che una diminuzione netta del tasso di ricombinazione delle coppie radicali.

È anche possibile per l’enzima rafforzare il legame CoC e sfavorire l’omolisi comprimendo l’interazione Co-α-N apicale. Sono state studiate le proprietà termodinamiche degli analoghi dell’adenosilcobinamide + e +.68 Un legame CoC più forte è stato osservato in + con una distanza di legame CoN più breve rispetto alla piridina come base α-assiale. Il legame CoC più forte porta a uno spostamento significativo verso l’eterolisi come via preferita. In questo sistema modello, l’enzima in studio, la metilmalonil-CoA mutasi, deve impedire l’eterolisi CoC o seguire una via eterolitica.68

Nella metionina sintasi, la porzione corrinica della cobalamina è inserita tra due domini di un frammento di 27 kDa, con la coda nucleotidica che penetra in una tasca profonda formata da residui del dominio C-terminale.7,69,70 Questa sequenza contiene una regione di moderata idrofobicità che è affiancata da estesi segmenti idrofili.71 Ci si aspettano somiglianze strutturali tra i domini che si interfacciano con l’anello di corrina. Il dominio α/β che lega la metà inferiore dell’anello di corrina e ospita la coda estesa del nucleotide (moiety fosfodiestere e gruppo 5,6-dimetilbenzimidazolo) nella metionina sintasi e nella metilmalonil-CoA mutasi è atteso anche nella glutammato mutasi (vide infra).