Accessibilità e architettura della cromatina

Figura 3: Tecniche di conformazione del cromosoma. Varie fasi di 3C, 4C, 5C, ChIA-PET, e Hi-C.

Chromatin conformation capture (3C)

3C utilizza la reticolazione della formaldeide per bloccare la struttura tridimensionale della cromatina in posizione, seguita da digestione con enzimi di restrizione. I frammenti di DNA estratti vengono poi analizzati tramite qPCR e sequenziamento per identificare dove le regioni di DNA distanti sono collegate. Questo approccio per analizzare la struttura della cromatina 3D e le interazioni in vivo è stato sviluppato per la prima volta nel 2002 (Dekker et al., 2002), e da allora è diventato il fondamento per una serie di tecniche correlate che sono state sviluppate per raggiungere una maggiore scala, throughput, o specificità.

Circularzed chromosome conformation capture (4C)

4C permette l’identificazione di regioni di DNA precedentemente sconosciute che interagiscono con un locus di interesse, che rende 4C ideale per scoprire nuove interazioni all’interno di una regione specifica (Dekker et al, 2006).

4C suggerimenti utili:

• Scegliere i giusti enzimi di restrizione. Tagliatori più frequenti (cioè quattro siti di riconoscimento bp) sono migliori per le interazioni locali tra la regione di interesse e sequenze vicine sullo stesso cromosoma (van der Werken et al., 2012).
• Ottimizzare cross-linking. Concentrazioni di formaldeide più basse promuovono l’auto-legatura indesiderata della regione di interesse, ma impediscono anche le “palle di pelo” di DNA che ostacolano il taglio dell’enzima di restrizione. Alte concentrazioni di formaldeide abbassano gli eventi di auto-legatura ma aumentano le palle di pelo. Una concentrazione ottimale di formaldeide dovrebbe essere scelta per la specifica situazione sperimentale per bilanciare queste considerazioni. 1% trattamento formaldeide per 10 min è un buon punto di partenza per la maggior parte degli esperimenti (van der Werken et al., 2012).

Cattura conformazione cromosoma copia carbone (5C)

5C genera una libreria di qualsiasi prodotti di legatura da regioni di DNA che si associano con i loci di destinazione, che vengono poi analizzati da NGS. 5C è ideale quando è necessario un grande dettaglio su tutte le interazioni in una data regione, per esempio quando si diagramma una matrice di interazione dettagliata di un particolare cromosoma. Tuttavia, il 5C non è veramente a livello di genoma, poiché ogni primer 5C deve essere progettato individualmente, quindi è più adatto a regioni specifiche (Dotsie e Dekker, 2007).

5C suggerimenti utili:

• Selezionare il giusto enzima di restrizione. Scegliere un enzima che funzioni in modo efficiente nelle tue specifiche condizioni sperimentali è essenziale. Per esempio, BamHI non è raccomandato per la maggior parte degli esperimenti a causa dell’inefficienza in condizioni 3C (Dotsie et al., 2007).
• Ottimizzare il disegno del primer. 5C utilizza due primer: un primer avanti 5C che si lega a monte del sito di legatura, e un primer inverso che si lega immediatamente a valle. La lunghezza del primer dovrebbe essere regolata in modo che la temperatura di annealing sia di circa 65°C per permettere ai primer di annealarsi esattamente con i loro frammenti di restrizione. Assicurati che i primer 5C siano sintetizzati con un fosfato all’estremità 5′ per la legatura.
• Usa un template di controllo. Questo controllerà le differenze nell’efficienza dei primer. Si raccomanda una libreria di controllo costruita dall’intera regione genomica in studio. Se questa libreria non è costruita, allora i ricercatori dovrebbero essere consapevoli che le frequenze di interazione sarebbe meno preciso.

Chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing (ChIA-PET)

ChIA-PET prende aspetti di ChIP e 3C per analizzare l’interazione di regioni di DNA distanti attraverso una particolare proteina.

ChIA-PET è meglio usato per esperimenti di scoperta che coinvolgono una proteina di interesse e sconosciuti DNA legante obiettivi. Siti di legame del fattore di trascrizione, per esempio, sono meglio studiati con ChIA-PET poiché questa tecnica richiede il DNA per essere legato dal fattore di trascrizione in vivo per l’interazione da chiamare (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET suggerimenti utili:

• sovrapporre tag PET per ridurre lo sfondo. Come la maggior parte delle tecnologie 3C, il rumore di fondo è una sfida tecnica. In ChIA-PET in particolare, il rumore può rendere difficile trovare interazioni a lungo raggio con il locus di interesse. Un suggerimento utile per superare questo è quello di richiedere che le PET si sovrappongano ad entrambe le estremità della regione per essere un’interazione a lungo raggio.

ChIP-loop

ChIP-loop è un mix di ChIP e 3C che impiega anticorpi mirati alle proteine sospettate di legare una regione di DNA di interesse. ChIP-loop è ideale per scoprire se due regioni note del DNA interagiscono attraverso una proteina di interesse. ChIP-loop è anche adatto alla conferma di sospette interazioni, ma non alla scoperta di nuove interazioni (Horike et al., 2005).

ChIP-loop suggerimenti utili:

• Evitare loop non nativi. Il più grande problema incontrato con ChIP-loop è la formazione di loop non nativi che si formano durante la concentrazione del DNA prima che avvenga la legatura. Un modo semplice per evitare questo è quello di scegliere un protocollo che esegue la precipitazione dopo la fase di legatura (Simons et al., 2007).
• Convalidare le interazioni ChIP-loop. Un’altra sfida in ChIP-loop può essere accurata quantificazione dei prodotti di legatura. Le tecnologie 3C, specialmente ChIP-loop, spesso catturano interazioni casuali. Per combattere questo, considerare l’esecuzione di un esperimento ChIP in parallelo e utilizzarlo per convalidare le interazioni ChIP-loop. Se un’interazione DNA-proteina-DNA identificata da ChIP-loop è davvero reale, allora entrambe le interazioni DNA-proteina dovrebbero apparire anche nei dati ChIP (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifica i prodotti di legatura dall’intero genoma e valuta le loro frequenze tramite sequenziamento ad alta produttività. Hi-C è una grande scelta quando è richiesta un’ampia copertura dell’intero genoma, e la risoluzione non è di grande preoccupazione, mappando i cambiamenti a livello di genoma nella struttura cromosomica nelle cellule tumorali (Lieberman-Aiden et al., 2009), per esempio.

Consigli utili Hi-C:

• Ottimizzare l’amplificazione della libreria. Hi-C amplificazione biblioteca deve generare abbastanza prodotto per l’analisi, evitando artefatti PCR. Per fare questo, il numero di cicli di PCR dovrebbe essere ottimizzato (nell’intervallo di 9-15 cicli). Se non è possibile produrre abbastanza prodotto (50 ng di DNA), più reazioni di PCR dovrebbero essere raggruppati piuttosto che il numero di ciclo aumentato, cinque reazioni sono solitamente sufficienti (Belton et al., 2012).
• Equilibrare le lunghezze di lettura. Come per qualsiasi esperimento di sequenza, le letture di alta qualità sono fondamentali. La lunghezza di lettura deve essere ottimale per bilanciare la necessità di lunghe letture per mappare le interazioni, ma non troppo lungo per passare attraverso la giunzione di legatura nel frammento partner. Pertanto, 50 bp legge sono ottimali nella maggior parte dei casi (Belton et al., 2012).
• Scegliere una dimensione appropriata bin. Questo è fondamentale per l’analisi dei dati. La dimensione del bin dovrebbe essere inversamente proporzionale al numero di interazioni previste in una regione. Utilizzare bidoni più piccoli per le interazioni intra-cromosomiche più frequenti e bidoni più grandi per le interazioni inter-cromosomiche meno frequenti (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C utilizza una combinazione di 3C e tecnologia di cattura degli oligonucleotidi (OCT), insieme al sequenziamento ad alta produttività per studiare centinaia di loci in una sola volta. Capture-C è ideale quando sono richieste sia l’alta risoluzione che la scala genomica. Per esempio, analizzando l’effetto funzionale di ogni SNP associato alla malattia nel genoma sulla struttura locale della cromatina (Hughes et al., 2014).

Capture-C suggerimenti utili:

• Scegliere con attenzione le posizioni della sonda. È meglio posizionare le sonde vicino ai siti degli enzimi di restrizione, anche sovrapposte quando possibile (Hughes et al., 2014).
• Mantenere le librerie complesse. Mantenere la complessità della libreria è la massima priorità. Una biblioteca complessa significa più interazioni di alta qualità nell’output. Per questo motivo, tutto ciò che potrebbe diminuire la complessità della biblioteca dovrebbe essere evitato, come una cattura di biotina Hi-C (Hughes et al., 2014).
• Attenzione alle false interazioni nelle regioni duplicate. Il processo di mappatura può stimolare forti interazioni tra queste regioni (come pseudogeni) che sono in realtà artefatti (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y e Dekker J (2012). Hi-C: una tecnica completa per catturare la conformazione dei genomi. Metodi, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M e Kleckner N (2002). Catturare la conformazione dei cromosomi. Science, 295, 1306-1311.

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Dostie J e Dekker J (2007). Mappatura delle reti di interazioni fisiche tra elementi genomici utilizzando la tecnologia 5C. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y e Dekker J (2007). Cromosoma conformazione cattura tecnologia di copia di carbonio. Curr Protoc Mol Biol, Capitolo 21, Unità 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF e Kohwi-Shigematsu T (2005). Perdita di looping di cromatina silente e imprinting alterato di DLX5 nella sindrome di Rett. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). Un recettore estrogeno-alfa-bound cromatina umana interactome. Natura, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Mappatura completa delle interazioni a lungo raggio rivela principi di piegatura del genoma umano. Scienza, 326, 289-293.

Hughes JR (agosto 2014). Intervista via e-mail.

Hughes JR, et al. (2014). Analisi di centinaia di paesaggi cis-regolatori ad alta risoluzione in un unico esperimento high-throughput. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J e de Laat W (2007). Una valutazione dei metodi basati su 3C per catturare le interazioni del DNA. Nat Methods, 11, 895-901.

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