ISH: protocolo de hibridação in situ

Armazenamento de amostras

Preservação do RNA
A preservação do RNA é dificultada devido à presença da enzima RNase. Esta enzima é encontrada em artigos de vidro, em reagentes e em operadores e suas roupas. O RNase destrói rapidamente qualquer RNA na célula ou na própria sonda de RNA, pelo que os utilizadores devem assegurar-se de que utilizam técnicas, luvas e soluções esterilizadas para evitar a contaminação do RNase da sonda ou do RNA tecidual.

Armazenamento geral das amostras quando se utilizam secções congeladas
Para melhores resultados em lâminas mais antigas, não armazenar as lâminas secas à temperatura ambiente. Em vez disso, armazenar em etanol 100% a -20°C, ou em uma caixa plástica revestida com plástico saran a -20°C ou -80°C. Tal armazenamento preserva as lâminas durante vários anos.

Escolha da sonda

Sondas de RNA

Sondas de RNA devem ter 250-1.500 bases de comprimento; as sondas de aproximadamente 800 bases de comprimento apresentam a maior sensibilidade e especificidade. Os modelos de transcrição devem permitir a transcrição tanto de RNAs de sondas (fio antisense) como de RNAs de controle negativo (fio sense strand). Clonar em um vetor com promotores opostos para conseguir isso. Os modelos circulares devem ser linearizados antes de fazer uma sonda, embora também possam ser utilizados modelos PCR.

Sondas de ADN

Sondas de ADN fornecem alta sensibilidade para hibridação in situ. Não hibridizam tão fortemente as moléculas de mRNA alvo em comparação com as sondas de RNA, pelo que o formaldeído não deve ser utilizado nas lavagens pós-hibridação.

Probe specificity is important. Se a seqüência exata do nucleotídeo do mRNA ou DNA na célula for conhecida, uma sonda complementar precisa pode ser projetada. Se >5% dos pares de bases não forem complementares, a sonda só se hibridizará frouxamente para a sequência alvo. Isto significa que é mais provável que a sonda seja lavada durante os passos de lavagem e detecção e pode não ser correctamente detectada.

Protocolo de hibridação in situ da sonda de RNA marcada com Digoxigenina (DIG)

Este protocolo descreve o uso de sondas de RNA marcadas com DIG para detectar a expressão do gene de interesse em seções em parafina.

1) Deparaffinização

Para seções congeladas, começar no Passo 2. Se usando seções em parafina fixadas em formaldeído, continue com este passo.

Antes de prosseguir, as lâminas devem ser desparafinizadas e reidratadas. A remoção incompleta da parafina pode causar má coloração da seção.

Colocar as lâminas em um bastidor e realizar as seguintes lavagens:

• Xileno: 2×3 min
• Xileno 1:1 com 100% de etanol: 3 min
• 100% de etanol: 2×3 min
• 95% de etanol: 3 min
• 70% etanol: 3 min
• 50% etanol: 3 min
• Enxaguar com água fria da torneira

Cuidar as lâminas na água da torneira até à recuperação do antigénio. A partir deste ponto as lâminas não podem secar, pois isto irá causar ligação de anticorpos não específicos e coloração de fundo elevada.

2) Recuperação de antígeno

Digest com 20 µg/mL de proteinase K em Tris pré-aquecido 50 mM durante 10-20 min a 37°C. O tempo de incubação e a concentração de proteinase K podem requerer optimização.

Recomendamos a realização de uma experiência de titulação da proteinase K para determinar as condições óptimas. Uma digestão insuficiente reduzirá o sinal de hibridação e uma digestão excessiva resultará numa morfologia deficiente dos tecidos, tornando a localização do sinal de hibridação muito difícil. A concentração ótima de proteinase K variará dependendo do tipo de tecido, comprimento de fixação e tamanho do tecido.

3) Enxágüe as lâminas 5x em água destilada.
4) Mergulhe as lâminas em ácido acético 20% (v/v) gelado por 20 seg. Isto permeabiliza as células para permitir o acesso à sonda e ao anticorpo.
5) Desidratar as lâminas por lavagem durante aproximadamente 1 min. por lavagem em etanol 70%, etanol 95% e etanol 100%, depois secar ao ar.
6) Adicionar 100 µL de solução de hibridação a cada lâmina.

Sal solução (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Solução de Denhardt (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polivinilpirrolidina)
• 10 g de albumina de soro bovino (BSA)
• 500 mL dH2O

7) Incube as lâminas durante 1 h numa câmara de hibridação humidificada à temperatura de hibridação desejada. As temperaturas típicas de hibridação variam entre 55-62°C.
8) Diluir as sondas em solução de hibridação em tubos PCR. Aquecer a 95°C durante 2 min num bloco de PCR para desnaturar o RNA ou a sonda de ADN. Arrefecer imediatamente no gelo para evitar o recozimento.
9) Drenar a solução de hibridação. Adicionar 50-100 μL de sonda diluída por secção, cobrindo toda a amostra. Incubar na câmara de hibridação humidificada a 65°C durante a noite. Cubra a amostra com um slip de cobertura para evitar a evaporação.

Durante este passo, a sonda de RNA hibridizará para o mRNA correspondente, ou a sonda de DNA hibridizará para o DNA celular correspondente. Otimizar a temperatura de hibridação em função da seqüência da sonda utilizada, assim como do tipo de célula ou tecido. Esta temperatura deve ser otimizada para cada tipo de tecido analisado.

Temperatura de hibridação ideal para as sondas depende da porcentagem de bases presentes na seqüência alvo. A concentração de citosina e guanina na sequência são factores importantes.

10) Lavagens com Stringency

Parâmetros de solução como temperatura, sal e concentração de detergente podem ser manipulados para remover interacções não específicas.

Para preparar 1 L de citrato de sódio 20x salino (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g de citrato de sódio
• 800 mL de dH2O
• Ajustar ao pH 5 usando ácido cítrico, preencher com 1 L e autoclave

Lash 1

• 50% formol em 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Lavagem da sonda em excesso e buffer de hibridação com temperaturas mais elevadas (até 65°C) por curtos períodos de tempo. Se for deixado demasiado tempo, pode lavar grande parte da sonda hibridizada RNA/DNA.

Alavagem 2

• 0.1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Este passo remove a hibridação não específica e/ou repetitiva de ADN/RNA.

Seguir estas directrizes para optimizar a temperatura e a concentração de sal para lavagens com strings:

• Para sondas de ADN/RNA muito curtas (0.5-3 kb) ou sondas muito complexas, a temperatura de lavagem deve ser menor (até 45°C) e a stringency menor (1-2x SSC).
• Para sondas monolocais ou grandes, a temperatura deve ser em torno de 65°C e a stringency alta (abaixo de 0.5x SSC).
• A temperatura e a stringency devem ser mais altas para sondas repetitivas (como as repetidas alfa satélite).

11) Lavar duas vezes em MABT (tampão de ácido maleico contendo Tween 20) durante 30 min à temperatura ambiente. MABT é mais suave que o PBS e é mais adequado para a detecção de ácido nucleico.

Para preparar 5x MABT de reserva

• 58 g de ácido maleico
• 43,5 g de NaCl
• 55 g de Tween-20
• 900 mL de água

Brugar o pH a 7,5 adicionando a base de Tris. Serão necessários cerca de 100 g. Traga o volume final para 1 L.

12) Secar as lâminas.
13) Transferir para uma câmara humidificada e adicionar 200 µL de tampão de bloqueio a cada secção (MABT + 2% BSA, leite ou soro). Bloquear durante 1-2 h à temperatura ambiente.
14) Drenar o tampão de bloqueio. Adicione o anticorpo anti-etiqueta à diluição necessária no tampão de bloqueio. Verifique a folha de dados do anticorpo para uma concentração/diluição recomendada. Incube durante 1-2 h à temperatura ambiente.
15) Lave as lâminas 5×10 min com MABT à temperatura ambiente.
16) Lave as lâminas 2×10 min cada à temperatura ambiente com tampão de pré-coloração (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) Para detecção de fluorescência, prossiga para o Passo 18. Para outras formas de detecção, devolva as lâminas à câmara humidificada e siga as instruções do fabricante para o desenvolvimento da cor.

18) Enxágüe as lâminas em água destilada.
19) Secar as lâminas ao ar durante 30 minutos. Lave em 100% etanol e seque ao ar completamente.
20) Monte usando a solução de montagem DePeX.