VIRAL PLAQUE ASSAY

Az anyagok:

30ml exponenciális SF9 sejtkultúra 5×105 sejt/ml mennyiségben

6 lyuklemez (2 db)

1 palack 4%-os agaróz gél

1 palack SF-900 (1.3X) táptalaj

1 steril palack

0,5ml baculovírus szupernátrium

100ml SFM

1. Steril körülmények között adagoljunk 2 ml sejtszuszpenziót lyukanként.

2. Hagyjuk, hogy a sejtek leülepedjenek a lemez aljára, és inkubáljuk lefedve, RT-n 1 órán át.

3. Helyezzük az agaróz gél üvegét a 70oC-os vízfürdőbe. Helyezze az üres palackot és az SF-900-at (1,3X) a 40oC-os fürdőbe.

4. A lemezek 1 órás RT-n történő inkubálását követően figyelje meg a monolayereket inverz mikroszkóp alatt, hogy megerősítse a sejtek rögzülését és az 50%-os konfluenciát.

5. A sejtek rögzülését és 50%-os konfluenciáját. Készítsünk nyolc-log soros hígítást a begyűjtött vírusos felülúszóból úgy, hogy 0,5 ml előző hígításból 4,5 ml SFM médiumban 12 ml-es eldobhatóban egymás után 0,5 ml-t hígítunk. A végén 8 csőnek kell tartalmaznia az eredeti vírusállomány egy-egy 10-1-10-8 hígítását.

7. Szekvenciálisan távolítsa el a felülúszót minden egyes üregből, dobja el, és azonnal helyettesítse 1 ml megfelelő vírushígítással minden egyes duplikált üregbe. Inkubáljuk 1 órán át a hőmérsékleten.

8. Amikor az agaróz folyékonnyá válik (20-30 perc), helyezzük át a palackokat a vízfürdőből a steril motorháztetőbe.Gyorsan adagoljunk 30 ml SF-900 (1,3X) táptalajt és 10 ml 4%-os agarózzselét az üres palackba, és óvatosan keverjük össze. Használatig tegye vissza a plakkozó fedőanyagot tartalmazó palackot a 40oC-os vízfürdőbe.

9. E második 1 órás inkubációt követően tegye vissza a hígított agarózt tartalmazó palackot és a 6 lyukú lemezeket a motorháztetőbe.

10. Szekvenciálisan (a magas hígítástól az alacsony hígításig) távolítsa el a vírust a lyukakból, és helyezze vissza 2 ml hígított agarózzal. Gyorsan dolgozzon, hogy elkerülje a monoréteg kiszáradását.Egy vákuumszivattyúhoz csatlakoztatott Pasteur-pipetta könnyen eltávolítja az inokulum nyomait.

11.Mozgatás előtt hagyja a gélt 10-20 percig megkeményedni.

12.Inkubálja 27oC-on, párásított inkubátorban 4-10 napig.

13.A rekombináns vírus enyhe kontrasztú, tejszerű/szürke plakkokat hoz létre, amelyek festés vagy más kimutatási módszerek nélkül is láthatók.

14.Monitorozza a lemezeket naponta, amíg a megszámlált plakkok száma két egymást követő napon keresztül nem változik.

15.Az alkalmazott oltóanyag titerének meghatározásához a számlálás optimális tartománya 3-20 plakk egy 6 lyukú lemez lyukában. A titer (pfu/ml) a következő képlettel számítható ki:

16. Az agaróz természetes vörös színezékkel történő átfedése:

Készítsünk 0,5%-os agaróz oldatot SFM-ben

Adjunk hozzá Natural Red oldatot 50 mg/ml végső koncentrációig (3,33 mg/ml törzsoldat 1:66,6 arányban hígítva).

Helyenként (6 lyukú lemezen) 1 ml festékoldatot helyezzünk minden egyes lyukba.

Helyenként 1 ml-t a festékoldatból.