Spontán emulgeálással vagy nagynyomású homogenizálással előállított lecitin alapú nanoemulziók fizikai-kémiai tulajdonságai

ARTIGO

Spontán emulgeálással vagy nagynyomású homogenizálással előállított lecitin alapú nanoemulziók fizikai-kémiai tulajdonságai

Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Közepes láncú triglicerid olajmagból álló, repce- vagy napraforgó lecitinekkel stabilizált nanoemulziókat állítottunk elő spontán emulgeálással és nagynyomású homogenizálással. Ezeket a nanoemulziókat tojáslecitinnel stabilizált készítményekkel hasonlítottuk össze. A nagynyomású homogenizálással előállított nanoemulziók nagyobb cseppméretet mutatnak (230-440 nm) a spontán emulgeálással előállítottakhoz képest (190-310 nm). Az emulziók zéta-potenciálja negatív és -25 mV alatti volt. A zétapotenciál inverziója 3,0 és 4,0 pH között következett be. Az eredmények bizonyítják a repce- vagy napraforgólecitint tartalmazó lipidemulziók spontán emulgeálással és nagynyomású homogenizálással történő előállításának megvalósíthatóságát.

Kulcsszavak: nanoemulzió; lecitin; parenterális; nagynyomású homogenizálás; spontán emulgeálás.

BEVEZETÉS

A parenterális táplálási rend alapvetően makrotápanyagokból (aminosavak, szénhidrátok és lipidek) és mikrotápanyagokból (vitaminok, elektrolitok és mikroelemek) áll, az orvos előírása alapján, a beteg állapotától, korától és súlyától függően.1 Az emulzióként adagolt lipid makrotápanyagok energiadonorok, esszenciális zsírsav beszállítók és zsírban oldódó vitaminok hordozói. Az ezekben a készítményekben található zsírsavaknak nagy metabolikus jelentőségük van, mivel a sejtmembránok alkotórészei, és specifikus szerepet játszanak a hormonális szignalizációban és szállításban. Ezenkívül a prosztaglandinok, leukotriének, tromboxánok és prosztaciklinek prekurzorai, amelyek modulálják a gyulladásos folyamatokat, a vesefunkciót és a vérlemezkék aggregációját.2 A koraszülötteknél az agyfejlődés során fellépő esszenciális zsírsavhiány tanulási problémákhoz és a látásfunkciók károsodásához vezet, ami visszafordíthatatlan lehet, még akkor is, ha a fejlődés későbbi szakaszában megfelelő zsírsavtartalmú étrendet kapnak.2

A szülői lipidemulziók heterogén rendszerek, amelyek egy emulgeálószer jelenlétével egy vizes fázisban (diszpergálószer) homogén módon diszpergált olajos fázisból állnak. A kis cseppméret, általában 200 és 500 nm között, jellemzi a készítményeket, mivel a nagyobb részecskék használata miatt fennáll az embólia veszélye. Az emulzióknak fiziológiailag kompatibilis pH-t (7 körül), izotóniát, alacsony viszkozitást és magas zéta-potenciált (modulusban) kell mutatniuk, hogy megelőzzék az instabilitási jelenségek előfordulását.3

A lipid-nanoemulziókat gyakran alkalmazzák a teljes parenterális táplálás adalékanyagaiban, az úgynevezett 3 az 1-ben rendszerekben, amelyekben az összes makro- és mikrotápanyagot egy etilvinilacetát (EVA) tasakba adják. Ezek a keverékek azonban némi fizikai instabilitást mutatnak az elektrolitok és más komponensek jelenlétével kapcsolatban, amelyek kicsapódhatnak vagy kölcsönhatásba léphetnek az emulziós cseppekkel. A kalcium és a foszfát kicsapódásáról széles körben beszámolnak az irodalomban. Továbbá a kétértékű ionok (mint például a kalcium és a magnézium) befolyásolhatják az emulzió zéta-potenciálját, és a lipidcseppek aggregációját/flokkulációját, majd koaleszcenciáját idézhetik elő. Ez a jelenség nagyon súlyos, mert minden 5 µm-nél nagyobb átmérőjű csepp, amely a véráramba kerül, zsírembóliát okozhat.4,5

A lipidemulziók fizikai jellemzői és ebből következő stabilitása erősen összefügg az előállítási módszerrel és összetétellel.3,6 Az előállítási módszerek sokfélék, és egynél több lépést is igényelhetnek a csökkentett cseppméretű emulzió előállításához. Egy nagysebességű homogenizátor (Ultraturrax®) először például durva emulziót hozhat létre. A cseppméret csökkentése ezután nagynyomású homogenizálással, mikrofluidizálással vagy ultrahangosítással érhető el.7-9 Az előkezelést nem igénylő módszerek közé tartozik a spontán emulgeálás, amelyet elsősorban formulációs vizsgálatokban használnak, és laboratóriumi méretekben könnyen elvégezhető, mivel nem szükséges bonyolult berendezéseket használni.10

Az 1. táblázat a kereskedelemben kapható tipikus intravénás lipidemulziók összetételét mutatja. A leírt összetevőkön kívül a készítményeknek meg kell felelniük az injekciós készítményekre vonatkozó követelményeknek.11

A parenterális emulziók olajos fázisát hosszú láncú trigliceridek (LCT) alkotják, amelyek kombinálhatók közepes láncú trigliceridekkel (MCT), amint azt az 1. táblázat mutatja. Az LCT sokféle olajat tartalmaz, például napraforgó-, ricinus-, olíva- vagy, ami még gyakoribb, szójaolajat. Ezek az olajok mind 12 szénatomnál hosszabb zsírsavláncokat tartalmaznak. Az MCT-t a kókuszolaj zsírsavainak észteresítésével nyerik. Az injektálható emulzió stabilizálásához választott emulgeálószerek a lecitinek, mivel biokompatibilisek és biológiailag lebonthatók. A lecitinek poláros és semleges foszfolipidek természetes keverékei, amelyeket állati vagy növényi forrásból nyernek.12 A növényi forrásból származó lecitinek foszfolipid-összetétele az extrakció, a termesztés és egyéb feldolgozási körülmények miatt változhat.13 Elsősorban amfoter foszfolipideket tartalmaznak, mint például foszfatidil-kolin és foszfatidil-etanolamin, de negatív foszfolipidek is jelen lehetnek.

A parenterális tápláláshoz kereskedelmi forgalomban kapható lipidemulziók leggyakrabban tojássárgája lecitinből vagy ritkán szójalecitinből (Solipid® E&S) állnak. A zsírpótlás számos előnye ellenére vannak jelentések a hosszú távú pótlással kapcsolatos káros klinikai hatásokról, amelyek a metabolikus korlátozások és a kritikusan beteg betegek immunreakciói miatt jelentkeznek.14,15 A jelentések szerint a parenterális lipidemulziókkal kapcsolatos káros reakciók a szója- és tojássárgája lecitinek jelenlétéhez kapcsolódnak.16-18. A gyógyszer-élelmiszer allergia kölcsönhatások számos nemkívánatos reakcióhoz vezethetnek, a gyomor-bélrendszeri zavaroktól az anafilaxiáig.19

Ezzel összefüggésben folytatódik az alternatív nyersanyagok keresése, hogy olyan hipoallergén helyettesítő anyagokat találjunk, amelyek biztonságosabbak a betegeknél történő parenterális alkalmazáshoz. Ez a munka a különböző lecitinek keresését helyezi előtérbe azzal a céllal, hogy új alternatívákat találjunk a parenterális táplálásra szánt lipidemulziókhoz, vagy akár gyógyszerhordozóként, hogy a tojás- vagy szójaalapú emulgeálószerekre túlérzékeny betegek (különösen a koraszülöttek) számára a legbiztonságosabb lehetőségeket biztosítsuk. Törekedtünk a repce- vagy napraforgólecitinnel stabilizált parenterális lipid-nanoemulziók kifejlesztésére, és ezeket összehasonlítottuk a tojáslecitint tartalmazó nanoemulziókkal. Továbbá a spontán emulgeálással történő elkészítést összehasonlítottuk a parenterális lipidemulziók ipari előállítására általánosan használt nagynyomású homogenizálással.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Kémiai anyagok és reagensek

MCT, szójaolaj és tojássárgája (Lipoid E80®), repce- (Lipoid R100®) és napraforgó- (Lipoid H100®) lecitineket a Lipoid GmbH-tól (Ludwigshafen, Németország) kaptuk, amely a repce- és napraforgólecitint szívesen adományozta. A glicerint és az etanolt a Merck-től (Brazília), illetve a Sigma-Aldrich-tól (St. Louis, MO, USA) szereztük be. Az ultratiszta vizet Milli-Q® készülékből (Millipore, Billerica, USA) nyertük.

Nanoemulziók előállítása

A lipidemulziókat két módszerrel állítottuk elő három példányban: spontán emulgeálással és nagynyomású homogenizálással. A spontán emulgeálással kapott formulákat egy korábban leírt eljárás szerint készítettük el.10,20 Röviden, a szójaolajat MCT-vel, lecitinnel és etanollal kevertük. A glicerint vízben feloldottuk, amelyhez mérsékelt mágneses keverés mellett 30 percig lassan adtuk az etanolos fázist. Az oldószert ezután csökkentett nyomáson, rotációs elpárologtatóban végzett desztillációval távolítottuk el. A nagynyomású homogenizálással kapott készítményeket a korábban leírt módon állítottuk elő.21 Először a lecitint glicerint tartalmazó vízben diszpergáltuk, és 40 ºC-on mágneses keverés mellett kevertük, amíg homogén vizes fázist nem kaptunk. Az olajfázis szójaolajból és MCT-ből állt. Mind az olaj-, mind a vízfázist mágneses keverés alatt kevertük (15 percig, szobahőmérsékleten), hogy durva emulziót kapjunk. A durva emulziókat ezután IKA® Ultra-Turrax T8 keverővel (IKA® Works Inc., NC, USA) 9500 fordulat/perc fordulatszámon 2 percig kevertük, hogy nyers előemulziókat képezzünk, amelyeket egyenként nagynyomású homogenizálásnak vetettünk alá (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Kanada) 750 bar (10 000 psi) nyomáson 10 cikluson keresztül a végső emulzió előállításához. Az összes készítmény pH-értékét 0,01 mol L-1 NaOH oldattal 8,0-ra állítottuk be. Az emulziókat 4 ºC-on tároltuk. A készítményeket és összetevőiket a 2. táblázat tartalmazza.

Nanoemulziók fizikai-kémiai jellemzése

A készítmények pH-értékét közvetlenül a mintákban határoztuk meg közvetlenül az elkészítés után, kalibrált potenciométerrel (Digimed, São Paulo, Brazília), szobahőmérsékleten. Az átlagos cseppméretet és a polidiszperzitási indexet fotonkorrelációs spektroszkópiával (PCS), a zéta-potenciált pedig elektroforetikus mobilitással határoztuk meg, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, UK) segítségével 25 ºC-on. A mérésekhez a nanoemulziókat 1 mmol L-1 NaCl-oldatban hígítottuk a 2,0 és 8,0 egység közötti pH-tartományban. A viszkozitást 25 ºC-on (viszkoziméter-állandó, k = 0,0212), 25 ± 0,1 ºC-on kapilláris viszkozimetriával értékeltük. A folyadéknak a kapilláriscsőben a felső jelből az alsó jelig történő áramlásához szükséges időt rögzítettük másodpercben. Minden készítményt három példányban elemeztünk.

Morfológiai elemzés

A morfológiai vizsgálatot transzmissziós elektronmikroszkópiával (TEM) végeztük. A nanoemulzió egy cseppjét szénnel bevont rézrácsra (200 mesh) helyeztük, 2,0 %-os uranil-acetát oldattal negatívra festettük, és a vizsgálat előtt 24 órán át száradni hagytuk. Egy 80 kV-on működő JEM-1200 EXII műszert (JEOL, Tokio, Japán) használtunk.

Eredmények és értekezés

A jelen tanulmányban parenterális táplálásra vagy gyógyszerhordozásra szánt lipidemulziókat fejlesztettünk ki, amelyeket két növényi forrásból (repcéből (R) és napraforgóból (S)) nyert lecitin stabilizált, a parenterális emulziók hagyományos stabilizátorának, a tojássárgája lecitinnek (E) alternatívájaként. Az új készítmények hagyományos készítményekkel való összehasonlítása érdekében az összes többi emulziós összetevőt a kereskedelmi lipidemulziós termékekhez hasonló koncentrációban tartották. Ez a munka két különböző előállítási módszert is összehasonlít: a spontán emulgeálást és a nagynyomású homogenizálást.

A 3. táblázat az így kapott nanoemulziók fizikai-kémiai tulajdonságait mutatja be. A spontán emulgeálással kapott készítmények 220 és 300 nm közötti átlagos cseppméretet mutatnak a PCS által meghatározottak szerint. Elméletileg ez a tartomány a nagy emulziós stabilitás tartománya.11,22,23 Ahogy a cseppméret csökken, az öndiffúzió sebessége olyan mértékben nő, hogy a nagyon kicsi cseppek diffúziós keveréssel megakadályozhatók a habosodásban.7,23 A repce- vagy napraforgólecitint tartalmazó nanoemulziók kisebb átlagos cseppméretet mutatnak, mint a tojássárgája lecitint tartalmazóak. Hasonló eredményeket írtak le ugyanezzel a módszerrel előállított, kizárólag MCT-ből, mint olajfázisból álló és 2 % (m/m) tojáslecitinnel stabilizált nanoemulziókról.24 Ezen adatok alapján arra lehet következtetni, hogy az 1,2 %-os koncentráció elegendő a szójaolaj, MCT és víz keverékének emulgeálásához. Azonban, bár kis cseppméretet és alacsony polydiszperzitási indexet kaptunk, az emulziók nem maradtak fizikailag stabilak több mint egy hétig az elkészítést követően, amelyet követően vizuálisan fázisszétválás (koaleszcencia) volt megfigyelhető. A koaleszcencia folyamata egy irreverzibilis instabilitási jelenség, mivel az olajcseppek elveszítik határfelületeiket és nagyobb cseppekké olvadnak össze.25

A nanoemulziók minőségi és mennyiségi összetétele, az emulgeálószer típusa és az emulgeálás módszere mellett, közvetlenül befolyásolhatja a cseppméretet.7,23 Ezért egy második módszert is teszteltünk a nanoemulzió előállítására. A nagynyomású homogenizálást a gyógyszeriparban általában alkalmazzák ilyen készítmények előállítására, bár ipari méretekben. Az emulgeáláshoz rendelkezésre álló különböző módszerek közül ezt a módszert részesítik előnyben a hatékony cseppfelbontás miatt. Ez egy nagy energiájú módszer, ahol a méretcsökkentést úgy érik el, hogy a durva emulziót nagy nyomás alatt egy homogenizáló szelepen keresztül kényszerítik, ezáltal deformálják és csökkentik a cseppméretet.26 A spontán emulgeálás alacsony költségű, egyszerű és megbízható módszer, és a kísérleti vizsgálatokban általában ezt alkalmazzák a sokkal bonyolultabb és drágább nagynyomású homogenizátor helyett.

Amint azt a 3. táblázat mutatja, a nagynyomású homogenizálás a korábbi módszerhez képest nagyobb cseppméretet eredményezett a repce- (296 ± 18 nm) vagy napraforgó lecitint (417 ± 25 nm) tartalmazó nanoemulziókban, valamint a kontroll tojás-lecitin emulziókhoz (243 ± 12 nm) képest. Mindazonáltal ki kell emelni, hogy még ha a nagynyomású homogenizálás kevésbé hatékony is volt a cseppek felbontásában, nagyobb stabilitást kölcsönzött a készítményeknek. A spontán emulgeálással kapott emulziókkal ellentétben ezek vizuálisan legalább 30 napig stabilak voltak. Ezek az eredmények megerősítik az előállítási módszer fontosságát az emulzió stabilitásának megadásában.

Az intravénás alkalmazásokat figyelembe véve a lipidemulzió cseppek méreteloszlása még az átlagos cseppméretnél is fontosabb lehet. A nagy olajcseppek kis populációja elegendő lehet ahhoz, hogy zsírembóliát okozzon a betegekben.4,5 Az elkészített készítmények cseppméret-eloszlását az 1. ábra mutatja be.

Az 1. ábrán két populáció figyelhető meg a repce lecitinből (spontán emulgeálással nyert, 1C. ábra) és a napraforgó lecitinből (spontán emulgeálással vagy nagynyomású homogenizálással nyert, 1E és 1F ábra) álló készítményekben. Ennek eredményeként ezeknél a készítményeknél 0,20-nál magasabb polydiszperzitási indexet kapunk.

Az emulziók stabilitása összefüggésbe hozható a határfelületi filmjük (lecitin) összetételével és tulajdonságaival, mivel ez határozza meg a készítmények zéta-potenciálját és a cseppek közötti taszítást, ami az emulzió stabilizálásának egyik mechanizmusa.27 A lecitin foszfolipidek heterogén keveréke; heterogenitása rendkívül előnyös a határfelületi film folyékonysága miatt, összehasonlítva a tiszta foszfolipidekével.28 A lecitinkeverékek fő foszfolipidjei a foszfatidil-kolin és a foszfatidil-etanolamin, amelyek fiziológiás pH-n (7,4) töltés nélküliek. Kisebb mennyiségben savas lipidek, például foszfatidil-inozitol, foszfatidil-szerin és foszfatidil-glicerin is jelen lehetnek. Ezek a lipidek pH 7,0-nál ionizálódnak, és negatív felületi töltést okoznak az emulziós cseppeken, ami hozzájárul a stabilitásukhoz. Bármilyen hozzáadott anyag, amely zavarja ezt a töltést, valószínűleg megváltoztatja a rendszer stabilitását.29 Még ha a parenterális minőségű lecitin nagymértékben tisztított is, akkor is tartalmaz kis mennyiségben más foszfolipideket, amint azt a 4. táblázat mutatja, amely az ebben a vizsgálatban használt három lecitin-alapanyag összetételét írja le.

Amint azt a 3. táblázat mutatja, a repce- vagy napraforgólecitinből álló, spontán emulgeálással kapott nanoemulziók esetében kisebb zéta-potenciál (modulérték) figyelhető meg. A nagynyomású homogenizálással előállított nanoemulziók zéta-potenciáljában azonban nem figyelhető meg különbség. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a zéta-potenciált befolyásoló fő tényező az előállítási módszer. Bár csoportunk mindkét módszert optimalizálta, a kísérleti körülményeket általában a készítmények összetételének figyelembevételével kell beállítani. Az olyan paraméterek, mint a ciklusok száma és a nyomás módosíthatók a végső készítmények kívánt fizikai-kémiai tulajdonságainak elérése érdekében.30,31

A nanoemulziók zéta-potenciálja az emulgeálószer ionizációjától is függ. A keletkező töltés (modulusban) 40 mV-ról 25 mV alá történő csökkentése növelheti a flokkulációs és koagulációs sebességet.32 A különböző lecitinekből álló és különböző emulgeálási módszerekkel előállított nanoemulziók zéta-potenciálját és átlagos cseppméretét a 2,0 és 8,0 közötti pH-tartományban értékelték. Az eredményeket a 2. ábra mutatja be.

Az összes készítmény felületi töltése a pH 3,0 és 4,0 között nullára csökken, ahogyan azt korábban az Intralipid®, egy tojáslecitinnel stabilizált triglicerid emulzió esetében megfigyelték.25 A zéta-potenciál függ a pH-tól, mivel a H+ a foszfolipidek felületén a potenciált meghatározó ion, amelynek izoelektromos pH-ja 3,1.33 A pH csökkentése csökkent (kevésbé negatív) zéta-potenciált és gyorsabb flokkulációs sebességet eredményez.34 Az átlagos cseppméret kis mértékű növekedést mutat a zéta-potenciál inverziójának pH-jánál. A 3. ábrából arra lehet következtetni, hogy a nanoemulziók pH-jának lehetőleg 7,0-nál magasabbnak kell lennie, mivel ennél a pH-értéknél alakul ki egy plató, ahol az olajcseppek közötti maximális taszítás figyelhető meg.

Végezetül a nagynyomású homogenizálással előállított nanoemulziók olajcseppjeinek morfológiáját TEM-mel vizsgáltuk. A 3. ábra homogén és gömb alakú részecskéket mutat, ami azt mutatja, hogy az emulziós cseppek átlagos cseppmérete a nanométeres tartományban van. Ezek az eredmények megerősítik a korábbi cseppméretelemzést.

A nanoemulziók alacsony viszkozitású, newtoni viselkedésű rendszerek. Az emulzió viszkozitásának értékelése kulcsfontosságú, mivel a nagy viszkozitású emulziók intravénás beadása nagyon fájdalmas lehet a beteg számára.23,32 A különböző lecitinekből álló nanoemulziók hasonló viszkozitást mutatnak. A várakozásoknak megfelelően nem figyelhető meg összefüggés az átlagos cseppméret és a nanoemulziók viszkozitása között, mivel minden készítmény csak 10 % olajmagot tartalmazott.35 Ezzel szemben a különböző előállítási módszerekkel előállított készítmények esetében némi különbség figyelhető meg a viszkozitásban: a spontán emulgeálás kissé viszkózusabb emulziókat eredményezett.

Meg kell említeni, hogy a jelen munkában vizsgált nanoemulziók összetételei a kereskedelmi forgalomban kapható nanoemulziókon alapulnak, amelyekben tojáslecitin volt az emulgeálószer. Más emulgeálószer használata szükségessé teheti annak koncentrációjának és/vagy emulgeálási körülményeinek optimalizálását. A szójalecitinből (Solipid®) álló kereskedelmi injektálható nanoemulziók például 1,5 %-os emulgeálószer-koncentrációt igényelnek. Néha további társemulgeálószereket használnak az emulziók stabilizálására, valamint a kisebb polydiszperzitás és a kisebb cseppek elősegítésére. Alkalmazásuk azonban a gyógyszerhordozóként használt lipidemulziókra korlátozódik, mivel a készítményekből kis mennyiséget adnak be erre a célra: a parenterális tápláláshoz használt emulziókban nem gyakran alkalmaznak koemulgeálószereket, az ilyen készítmények nagy mennyisége és a biztonsági problémák miatt, különösen a koraszülöttek esetében. A nátrium-oleátot gyakran használják az injektálható lipidemulziók készítményeinek stabilizálására,36 anionos felületaktív anyagként és szolubilizáló szerként működve.27

Összefoglalás

Az eredmények bizonyítják, hogy a repce- vagy napraforgólecitinből álló injektálható lipidemulziók spontán emulgeálással és nagynyomású homogenizálással készíthetők a hagyományos tojás-lecitin nanoemulziók alternatívájaként a tojásszármazékokra érzékeny betegek számára. További vizsgálatokat kell végezni az emulgeálási körülmények optimalizálására a készítmények hosszú távú stabilitásának javítása érdekében.

HÁTTÉRI KÖSZÖNET

A szerzők köszönetet mondanak a Nemzeti Tudományos és Technológiai Fejlesztési Tanácsnak (CNPq) az anyagi támogatásért és a Lipoid GmbH-nak a rendelkezésre bocsátott anyagokért.

1. Waitzberg, D. L.; Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica, 1. kiadás, Atheneu: São Paulo, 2009.

2. Adolph, M.; Clin. Nutr. 2001,20,11.

3. Bruxel, F.; Laux, M.; Wild, L. B.; Fraga, M.; Koester, L. S.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2012,35,1827.

4. Antunes, M.; Guedes, J.; Arq. Bras. Med. 1994,68,303.

5. Trissel, L. A.; Gilbert, D. L.; Martinez, J. F.; Baker, M. B.; Walter, W. V.; Mirtallo, J. M.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1999,23,67.

6. Almeida, M. E.; Teixeira, H. F.; Koester, L. S.; Lat. Am. J. Pharm. 2008,27,780-88.

7. Benita, S.; Levy, M. Y.; J. Pharm. Sci. 1993,82,1069.

8. Robin, O.; Blanchot, V.; Vuillemard, J. C.; Paquin, P.; Lait 1992,72,511.

9. Mbela, T. K. M. N.; Ludwig, A.; Landau, I.; Deharo, E.; Haemers, A.; Int. J. Pharm. 1994,110,89.

10. Bouchemal, K.; Briançon, S.; Perrier, E.; Fessi, H.; Int. J. Pharm. 2004,280,241.

11. Klang, S.; Benita, S. In Submicron emulsions in drug targeting and delivery; Benita, S., ed; Harwood Academic Publishers: Amsterdam, 1998, chap. 5.

12. Szuhaj, B. F.; Sipos, E. F. In Élelmiszer-emulgeálószerek: Chemistry, Technology, Functional Properties and Application; Charalambous, G., Doxastakis, G., eds.; Elsevier Science Publishers B. V.: Amsterdam, 1989, chap. 10.

13. Schneider, M. In Lecithins: Sources, Manufacture, & Uses, American Oil Chemists’ Society: Illinois, 1989.

14. Szuhaj, B. F. In Bailey’s Industrial Oil and Fat Products; Shahidi, F., szerk.; John Wiley and Sons: New Jersey, 2005, 3. kötet, 3. fejezet. 13.

15. Adan, D.; La Gamma, E. F.; Browne, L. E.; Crit. Care Clin. 1995,11,751.

16. Himaya, D. T.; Griggs, B.; Mittman, R. J.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1981,13,318.

17. Buchman, A. L.; Ament, M. E.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1991,15,345.

18. Kamath, K. R.; Berry A.; Cummins, G.; New Engl. J. Med. 1981,304,360.

19. Wiesner, A. M.; Romanelli, F.; Stratman, R. C.; Smith, K. M.; Orthopedics 2008,31,149.

20. Yu, W.; Tabosa Do Egito, E. S.; Barrat, G.; Fessi, J. P.; Devissaguet, J. P.; Puisieux, F.; Int. J. Pharm. 1993,89,139.

21. Floyd, A. G.; Pharm. Sci. Technol. 1999,2,134.

22. Driscoll, D. F.; Pharm. Res. 2006,23,1959.

23. Constantinides, P. P.; Tustian, A.; Kessler, D. R.; Adv. Drug Deliver. Rev. 2004,56,1243.

24. Martini, E.; Carvalho, E.; Leão, F.; de Oliveira, M. C.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2007,30,930.

25. Washington, C.; Adv. Drug Deliver. Rev. 1996,20(2-3),131.

26. Walstra, P.; Smulders, P. E. A. In Modern Aspects of Emulsion Science; Binks, B. P., szerk.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 1998, chap. 12.

27. Lachman, L.; Liberman, H.; Kanig, L. J. Teoria e Prática na indústria farmacêutica; 3. kiadás, Lea & Febiger: Philadelphia, 2001.

28. Lawrence, M. J.; Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996,1,826.

29. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,66,1.

30. Dias, D. O.; Colombo, M.; Kelmann, R. G.; Souza, T. P. D.; Bassani, V. L.; Teixeira, H. F.; Anal. Chim. Acta 2012,721,79.

31. Fraga, M.; Laux, M.; Zandoná, B.; Santos, G. R.; Giuberti, C. S.; de Oliveira, M. C.; J. Drug Delivery Sci. Technol. 2008,18,398.

32. Jumaa, M.; Müller, B. M.; Int. J. Pharm. 1998,163,81; Roland, I.; Piel, G.; Delattre, L.; Evrard, B.; Int. J. Pharm. 2003,263,85.

33. Davis, S. S.; Galloway, M.; J. Pharm. Pharmacol. 1981,33,88.

34. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,64,67.

35. Silvander, M.; Hellstrom, A.; Warnheim, T.; Claesson, P.; Int. J. Pharm. 2003,252,123.

36. Formariz, T. P.; Sarmento, V. H. V.; Silva-júnior, A. A.; Scarpra, M. V.; Santilli, C. V.; Oliveira, A. G.; Colloids Surf., B 2006,51,54.

Elfogadva 2014.02.03; elfogadva 2014.04.17; publikálva az interneten 2014.07.15