Plasmid-mediált AmpC β-laktamáz CITM és DHAM gének Gram-negatív klinikai izolátumok között

Háttér

A Gram-negatív baktériumok egy része (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii és Pseudomonas aeruginosa) között kialakult és világszerte terjed. Az Enterobacterales családból az Escherichia coli és a Klebsiella spp. gyakran izolált organizmusok, amelyek figyelemre méltó gyógyszerrezisztenciával rendelkeznek. A β-laktámok a leggyakrabban felírt gyógyszerek e rezisztens törzsek ellen, és önmagukban a legújabb klinikai receptek mintegy kétharmadát teszik ki.1 Ez a csoport négy fő kémiai osztályt tartalmaz: penicillinek, cefalosporinok, karbapenemek és monobaktámok, amelyek közül a karbapenemeket a Gram-pozitív, Gram-negatív és anaerob baktériumok patogén törzsei elleni empirikus terápia utolsó menedékeiként alkalmazzák.2

A β-laktámokkal szembeni rezisztencia a β-laktamázok, azon hidrolitikus enzimek termelésének tulajdonítható, amelyek képesek inaktiválni az antibiotikumokat, mielőtt azok elérnék a citoplazmamembránon található penicillinkötő fehérjéket (PBP).3 A főbb β-laktamáz családok közé tartoznak a plazmid-mediált kiterjesztett spektrumú β-laktamázok (ESBL), az AmpC, a cefalosporinázok és a karbapenemáz. Valamennyi osztályt világszerte kimutatták, néhány közülük egyes országokban koncentrálódik.1

Az AmpC β-laktamázt kódoló gének széles körben elterjedtek és széles körben kimutathatók a bakteriális plazmidokban. Az első plazmidon kódolt AmpC-változatot először 1989-ben azonosították Dél-Koreában izolált Klebsiella pneumoniae-ből. CMY-1-nek nevezték el, mivel fenotípusos tulajdonsága a cephamycinázzal társult, és közismerten rezisztens volt a cefoxitinre.4,5 Rövid időn belül számos plazmid-mediált AmpC-variáns családot mutattak ki, elsősorban a K. pneumoniae és az E. coli izolátumaiból. A plazmid-mediált AmpC genotípusokkal rendelkező baktériumokat a nukleinsav szekvenciák homológiája alapján sorolták be, így nagyobb számú baktérium nemzetséget alkottak, amelyek e plazmidok és számos AmpC család forrásaként szolgáltak.6 Eddig a következő AmpC-családokról számoltak be világszerte: két CMY β-laktamázcsalád (CMY-1 és CMY-2), amelyeket Aeromonas hydrophilából és Citrobacter freundii-ből izoláltak; FOX- és MOX-típusú enzimek, amelyeket Aeromonas spp.; a H. alvei-ből származó ACC család; a C. freundii-ből izolált LAT cefalosporináz család; az Enterobacter spp.-ből származó MIR és ACT családok; és a Morganella morganii-ből izolált DHA család4,6,7. A plazmidok által kódolt AmpC gének többsége a nosokomiális fertőzésekben előforduló E. coli és K. pneumoniae izolátumokban található, míg más Gram-negatív baktériumok, például az E. cloacae, C. freundii, S. marcescens és M. morganii rezisztenciáját a kromoszómák által közvetített AmpC β-laktamázok adják, így fokozva a széles spektrumú cefalosporinokkal szembeni rezisztenciát.8 . Az ESBL-eket termelő, gyakran AmpC β-laktamázok együttes expressziójával jellemezhető organizmusok komoly veszélyt jelentenek a kórokozók diagnosztikájában és kezelésében.

Az AmpC β-laktamáz gének, különösen a MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM és ACCM felelősek a legtöbb β-laktámmal szembeni széles spektrumú rezisztencia kialakulásáért (a cefepim és a karbapenemek kivételével). Ezen kívül e gének megszerzése a baktériumokban tovább fokozhatja a rezisztenciát, mivel az A osztályú enzimek gátlói (beleértve a klavulánsavat, a szulbaktámot és a tazobaktámot) és a p-klórmerkuri-benzoát nem hatékonyak az AmpC β-laktamázok ellen, bár néhányat közülük a tazobaktám vagy a szulbaktám gátolhat.6

Noha erőfeszítéseket tesznek a gyógyszerrezisztens kórokozók növekedésének és terjedésének megfékezésére, az AmpC β-laktamázokkal kapcsolatos vizsgálatok korlátozott erőforrásokkal rendelkező környezetben még mindig nem megfelelőek. A növekvő antimikrobiális rezisztencia (AMR) kezelésének legfontosabb lépése a patogén (és/vagy rezisztens) törzsek pontos kimutatása a diagnosztikai laboratóriumokban. Ennek ellenére a rutinjelentésre szolgáló laboratóriumi protokollok Nepálban nem nyújtanak pontos eredményt, mivel az AmpC β-laktamázokat nehéz csak fenotípusos vizsgálatokkal azonosítani, és a klinikai laboratóriumokban gyakran tévesen ESBL-ként mutatják ki őket. Az ESBL fenotípus szűrővizsgálata során pozitív, de a megerősítő vizsgálat során negatívnak bizonyuló Enterobacterales izolátumokat általában potenciális AmpC β-laktamáz-termelőnek tekintik, amelyet vagy kromoszóma-depresszió vagy plazmidtranszfer révén kapnak.9

Még a szakértő klinikai mikrobiológusok sem tudják azonosítani a plazmid által közvetített AmpC β-laktamázt, ami arra utal, hogy pontosabb és specifikusabb módszerre van szükség a gyors kimutatáshoz. Ezen eljárások némelyike azonban erőforrás-igényes, gyakran nem könnyen hozzáférhető reagenseket igényel.10 Ezen okok miatt az AmpC β-laktamázok kimutatatlanok maradnak a klinikai mintákban. Ezért egy megbízhatóbb és validabb laboratóriumi protokollt dolgoztak ki, amely multiplex polimeráz láncreakcióból (PCR) áll, hogy megkönnyítsék a plazmid által kódolt AmpC gének diagnózisát, amelyek felelősek az AmpC β-laktamáz expressziójáért különböző klinikai fertőzésekben.11

A legtöbb tanulmány az ESBL enzimek prevalenciájára összpontosít a nepáli Gram-negatív klinikai izolátumokban.12-16 A nepáli Gram-negatív baktériumok AmpC β-laktamáz enzimeiről korlátozott számú tanulmány készült. Egy Katmandu völgyében végzett vizsgálat szerint az Enterobacterales izolátumok 27,8%-a volt AmpC β-laktamáz termelő fenotípusos módszerrel.17 Tudomásunk szerint Nepálban az AmpC β-laktamáz enzimek kimutatására és jellemzésére Gram-negatív baktériumokban fenotípusos és genotípusos módszerrel egyaránt korlátozott számú tanulmány létezik. Alapvető fontosságú az antibiotikum-érzékenységi vizsgálat standard fenotípusos és genotípusos módszereinek felállítása a kórházakban a gyógyszerrezisztens kórokozók szűrésére. Ezt a tanulmányt az AmpC β-laktamázok génjeinek (blaCITM és blaDHAM) izolálására és azonosítására vállalkoztunk Gram-negatív baktérium izolátumokban mind fenotípusos szűrési, mind megerősítő módszerekkel.

Módszerek

Tanulmány felépítése

Ez egy kórházi keresztmetszeti vizsgálat, amelyet 2017 júniusától 2018 januárjáig végeztünk az Annapurna Neurológiai Intézet és Társult Tudományos Intézetben (ANIAS). Összesen 1151 nem duplikált klinikai mintát gyűjtöttek és dolgoztak fel a vizsgálati időszak alatt. A minták között vizelet (n=412), vér (n=206), katéterhegy (n=163), genny (n=132), széklet (n=89), liquor (n=53), sebtampon (n=58) és hüvelytampon (n=38) szerepelt. A mintákat steril, jól felcímkézett és szivárgásmentes tartályban vették; és a lehető leghamarabb feldolgozták.18 A vizsgálatba bevonták az összes olyan látogató beteget, akinél felmerült a bakteriális fertőzés gyanúja, és aki beleegyezését adta a részvételhez. A nem megfelelő demográfiai adatokkal rendelkező vizsgálati résztvevőket kizárták.

A minták tenyésztése és az izolátumok azonosítása

A minták gyűjtése a vizelet, széklet, genny, vér, liquor és katéterhegy gyűjtésére vonatkozó standard mikrobiológiai irányelvek szerint történt. Az alkalmas mintákat a továbbiakban vér-agarra (BA), csokoládé-agarra (CA) és MacConkey-agarra (MA) oltották. Ezenkívül a vizeletmintákat kromogén UTI-agarra oltották. Az izolátumokat standard mikrobiológiai paraméterek, például a telepek morfológiai megjelenése, festési reakciók és biokémiai tulajdonságok alapján azonosították.19,20

Az antibiotikum-érzékenység vizsgálata

Minden azonosított Gram-negatív izolátumot in vitro antimikrobiális érzékenységi vizsgálatnak vetettek alá módosított Kirby-Bauer korongdiffúziós módszerrel.21 Először a baktériumtelepek tápanyag-agarból steril normál sóoldatba történő átültetésével inokulumokat készítettek. Az inokulumok zavarosságát a CLSI-irányelvek szerint 0,5 McFarland-szabványnak megfelelően állítottuk be. A vizsgálati inokulumok szőnyegtenyészetét Muller-Hinton-agaron (MHA) is elkészítettük. Az antibiotikumos korongokat (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, India) a következő arányban használtuk: Amoxicillin (10 μg), azitromicin (10 μg), amikacin (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitin (30 μg), ceftazidim (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), imipenem (10 μg), piperacillin/tazobaktám (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), cotrimoxazol (25 μg) és cefepim (30 μg). A beoltott lemezt 37 °C-on 18 óráig aerob módon inkubáltuk. Elegendő inkubáció után megmérték a lemezek körüli gátlási zónákat (ZOI), és az eredményt érzékenynek, közepesnek vagy rezisztensnek minősítették.21 A három vagy több különböző osztályba tartozó antibiotikummal szemben rezisztenciát mutató izolátumokat multidrog-rezisztenciaként értelmezték.22

AmpC β-laktamázok szűrése

Az izolátumokat először az esetleges AmpC β-laktamázok termelésére vizsgáltuk a CLSI 2019. évi iránymutatásai szerint.23 A szűréshez ceftazidim vagy cefotaxim vagy cefoxitin vagy ceftriaxon egyenként 30 µg-os mennyiségét vetettük alá AST-vizsgálatnak, és az ezekkel az antibiotikumokkal szemben rezisztens (≤ 18 mm átmérőjű gátlási zónát mutató) szervezeteket potenciális AmpC-termelőnek minősítettük, és további megerősítő vizsgálatoknak vetettük alá.

Az AmpC β-laktamázok megerősítése

A szűrés pozitív AmpC β-laktamáz termelőit AmpC lemezes teszttel és inhibitor alapú megerősítő teszttel (bórsav teszt) igazoltuk.

A bórsav tesztben a vizsgált szervezet szőnyegtenyészetét MHA lemezen készítettük 0,5 McFarland oldatokat véve. Két cefoxitin (30 µg) korongot, amelyek közül az egyikhez fenil-bórsavat (400 µg) adtunk, az MHA lemezen lévő szőnyegtenyészetre helyeztünk, majd inkubáltuk, és az eredményeket értelmeztük. Ha a kívánt antibiotikum korong (ceftazidim vagy cefotaxim) fenil-bórsavval kombinálva történő vizsgálatakor a gátlási zóna ≥5 mm-rel nőtt, mint a kombináció nélküli vizsgálat során (antibiotikum korong önmagában), az izolátumot pozitív megerősítő tesztnek jelöltük.

A korongközelítési tesztben korongokat helyeztünk az E. coli ATCC 25922 szőnyegtenyészetére. A lemez közepére 30μg ceftazidim korongot helyeztünk, amelyet 10μg imipenem, 30μg cefoxitin és 20/10μg amoxicillin/klavulanát korong követett, amelyeket a ceftazidim korongtól 20 mm távolságra helyeztünk. A tesztorganizmus kolóniáit egy koronghoz adtuk, majd a lemezt megfordítottuk és 24 órán át 37°C-on aerob körülmények között inkubáltuk. A ZOI bármilyen benyomódása vagy ellaposodása az izolátumok AmpC β-laktamáz termelését jelezte.20,24

Az AmpC β-laktamáz pozitív izolátumok tartósítása

A tartósításhoz glicerin készítménykészítési módszert használtunk. A szervezeteket 40% glicerint tartalmazó kriptikus szójalében (TSB) tartósítottuk, és -20ºC-on tároltuk.25

Plazmid DNS kivonás

A vizsgált szervezet izolált kolóniáját Luria Bertani (LB) tápoldatba oltottuk. Az inokulumot vízfürdős rázógép segítségével 37 °C-on 18-24 órán keresztül aerob módon inkubáltuk. Az így kapott tiszta tenyészetet lúgos-liázos módszerrel vizsgáltuk a plazmid DNS kivonása céljából. A kivont plazmid DNS-t ezután TE-pufferben szuszpendáltuk, és további vizsgálatokig -20°C-on tároltuk.26

Az AmpC β-laktamáz gének (blaCITM és blaDHAM) PCR-rel történő amplifikációja

Az AmpC β-laktamáz gének (blaCITM és blaDHAM) PCR-rel amplifikáltuk, plazmid DNS preparátumot használva templátként. A blaCITM génhez használt primerek a CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) és a CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) mint forward és reverse primer, míg a blaDHAM génhez a DHAM for (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) és a DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ) primereket használtuk.11 A reakció térfogatát 25µL-ben állítottuk be 12,5µL 1X master mix (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Észtország), 0,5µL egy-egy 0,5µL forward és reverse primer és 4µL DNS templát és 7,5µL ddH2O hozzáadásával. Mindkét gén optimális PCR-amplifikációja a következő volt: 94ºC 3 percig a kezdeti denaturáláshoz; 35 ciklus denaturálás 94ºC-on 30 másodpercig; 25 ciklus lágyulás 62ºC-on 30 másodpercig; 35 ciklus hosszabbítás 72ºC-on 1 percig; és végső hosszabbítás 72ºC-on 7 percig.11,27

DNS-tisztítás

A plazmid DNS-t etanolos kicsapási módszerrel tisztítottuk. Ennél a módszernél a DNS-pelletet jéghideg 70%-os etanollal öblítettük, majd 10 percig száradni hagytuk, ami megkönnyíti az alkohol elpárolgását. A DNS-pelletet Tris-t, EDTA-t és RNázokat tartalmazó pufferoldatban szuszpendáltuk a maradék szennyeződések kiürítéséhez.

A PCR-termékek kimutatása gélelektroforézissel

Az amplifikált termékeket gélelektroforézissel, 1,5%-os agarózgélen, 0,1µL etídium-bromiddal festett gélben tettük láthatóvá. A gél előkészítése után az első mélyedésbe 2µL 100bp DNS létrát adtunk markerként, egy másik mélyedésbe 2µL negatív kontrollt, egy másik mélyedésbe 2µL pozitív kontrollt, a többi mélyedésbe pedig 2µL PCR-terméket. Végül a gélt UV transz-illuminátor alatt vizualizáltuk.28

minőségi ellenőrzés

A vizsgálatban alkalmazott eljárásokhoz szabványos aszeptikus eljárást alkalmaztunk. A táptalajok és kémiai reagensek minden tételét aszeptikus technikával dolgoztuk fel a CLSI irányelvek szerint. Az AST-ben a minőségellenőrzést az E. coli ATCC 25922 kontrolltörzsek használatával tartották fenn. A PCR során a minőségellenőrzést mindkét vizsgált gént hordozó Klebsiella izolátumok használatával biztosítottuk, míg a vak vagy negatív kontrollokat nukleinsavak alkalmazása nélkül készítettük. Mindezeket a kontrollokat a PCR-vizsgálat minden egyes tételében felhasználtuk.

Statisztikai elemzés

Az adatok bevitele és elemzése az SPSS szoftver 24.0 verziójának használatával történt. A demográfiai változók, mint például a nem és az alanyok életkora között 95%-os konfidenciaintervallumon (CI) végzett Chi-négyzet tesztekkel vizsgáltuk az összefüggéseket.

Eredmények

A bevont betegek demográfiai és klinikai jellemzői

A bevont 1151 beteg közül 54,2% (624/1151) férfi és 45,8% (527/1151) nő volt. A 253 baktériumszaporulat 47,8%-a (121/253) férfi, 52,2%-a (132/253) pedig nő volt. Az összes (253) baktériumszaporulat 26,1%-a (66/253) vizeletmintából származott, ezt követte a katétervég (17,4%; 44/253), a vér (16,2%; 41/253), a genny (11,9%; 30/253) és a sebtampon (10,7%; 27/253). A betegek életkor szerinti megoszlása alapján a baktériumos kórokozók legnagyobb mértékű növekedését a 16-45 éves korcsoportban (39,5%; 100/253) találták, amelyet a 46-60 évesek (30,1%; 76/253), a >60 évesek (24,1%; 61/253) és a 0-15 évesek (6,3%; 16/253) követtek (1. táblázat).

1. táblázat Az Annapurna Neurológiai Intézet és Társintézményben kezelt betegek demográfiai és klinikai jellemzői

A baktériumizolátumok megoszlása a klinikai mintákban

Az összesen 1151 klinikai minta közül, 22%-a (253/1151) mutatott növekedést táptalajon. A 253 baktériumizolátum közül a legtöbb (89,3%; 226/253) Gram-negatív baktérium volt. A baktériumok között az E. coli (28,5%; 72/253) volt a domináns szervezet, amelyet a Pseudomonas aeruginosa (16,2%; 41/253), az Acinetobacter baumannii (15,8%; 40/253), a Gram-pozitív baktériumok (10,7%; 27/253), a Klebsiella pneumoniae (9,9%; 25/253) és a Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (1. ábra)

1. ábra A bakteriális nemzetségek megoszlása a tenyészpozitív klinikai mintákban (n=253).

Az izolált Gram-negatív baktériumok antibiotikum-érzékenységi mintázata

A 226 Gram-negatív baktériumizolátumból 66.8%-a (151/226) bizonyult rezisztensnek a cefoxitinre, ezt követte a ceftazidim (58,4%; 132/226), a ciprofloxacin (53,5%; 121/226) és a cefepim (51.8%; 117/226), míg az izolátumok a meropenemre (69%; 156/226), ertapenemre (68,6%; 155/226), imipenemre (66,8%; 151/226), amikacinra (61,1%; 138/226), piperacillin/tazobaktámra (56,6%; 128/226) és az azitromicinre (53.1%; 120/226) (2. táblázat).

2. táblázat A Gram-negatív baktériumok izolátumainak antibiotikum-érzékenységi mintázata (n=226)

Multirezisztencia (MDR) mintázat az izolátumokban

A 226 izolátumból 46.9%-a (106/226) volt MDR rezisztens. A legnagyobb arányban az E. coli (31,1%; 33/106), majd a P. aeruginosa (20,8%; 22/106), az A. baumannii (18,9%; 20/106), a K. pneumoniae (9,4%; 10/106) és a K. oxytoca (4,7%; 5/106) MDR-t találták (2. ábra). Az egyes fajok közül a C. freundii (100%; 8/8) esetében volt a legmagasabb a multidrog-rezisztencia aránya, amelyet a P. aeruginosa (53,6% 22/41), a C. koseri (50%; 2/4), az A. baumannii (50%; 20/40) és az E. coli (45,8% 33/72) követett (2. ábra).

2. ábra Az MDR-baktériumok eloszlása és az összes MDR % és MDR az egyes fajokon belül.

AmpC kimutatása különböző tesztekkel

A 226 Gram-negatív izolátumból 50% (113/226) mutatott rezisztenciát a cefoxitin ellen. Az AmpC β-laktamáz termelő izolátumokat két különböző megerősítő teszttel, a lemezes és a bórsavas tesztekkel igazolták. A kilencvenegy izolátum 91,2%-a (83/91) mindkét tesztben pozitív eredményt mutatott, 8,8%-a (8/91) pedig csak a bórsav tesztben mutatott pozitív eredményt, amelyet legalább az egyik teszt megerősített, és AmpC β-laktamáz termelőnek minősült.

A blaCITM és blaDHAM gének előfordulása AmpC β-laktamáz termelő Gram-negatív izolátumokban

A PCR vizsgálatban az izolátumok 90,1%-a (82/91) és 87,91%-a (80/91) bizonyult pozitívnak a blaCITM és blaDHAM génekre. Ennek megfelelően az amplifikált blaCITM és blaDHAM gének 465bp és 405bp méretű amplikonokat mutattak ki (3. és 4. ábra).

3. ábra A PCR-termékek elválasztásához használt agaróz gélelektroforézis (1,5%). A 2. sáv pozitív kontroll; a 3., 5. és 7. sáv CITM pozitív; a 4. és 6. sáv CITM negatív; és a 8. sáv negatív kontroll.

4. ábra A PCR-termékek elválasztásához használt agaróz gélelektroforézis (1,5%). Lane 2, pozitív kontroll; Lane 3, 4, 6 és 7 Dham pozitív; Lane 5, Dham negatív; és Lane 8, negatív kontroll.

Az AmpC β-laktamáz, blaCITM és blaDHAM gének megoszlása a Gram-negatív izolátumok között és kapcsolatuk a nemmel, életkorral, klinikai mintákkal és klinikai izolátumokkal

A 91 AmpC-termelő izolátum közül 50,6% (46/91) női, 49,4% (45/91) férfi betegektől származott. Hasonlóképpen, a blaCITM gének azonos arányban (50%; 41/82) kerültek elő mindkét nemből származó mintákból, míg a blaDHAM gének 51,3%-át (41/80) és 48,7%-át (39/80) a férfi, illetve női betegektől származó mintákban mutatták ki. A beteg neme nem mutatott szignifikáns összefüggést az AmpC enzimek és AmpC gének termelődésével (3. táblázat).

3. táblázat Az AmpC β-laktamáz, CITM és DHAM gének megoszlása a Gram-negatív baktérium izolátumok között és kapcsolatuk a nemmel, az életkorral és a klinikai mintákkal

A legmagasabb számú AmpC β-laktamáz termelő (40.7%; 37/91) és a blaCITM-et (40,2%; 33/82) és blaDHAM-ot (41,2%; 33/80) termelő izolátumok prevalenciája a (46-60) éves korcsoportból származott, amelyet a (16-45) évesek (30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) és 31,3%; 25/80) követtek. Szignifikáns összefüggés volt az AmpC β-laktamáz enzimtermelés és a korcsoport között (p=0,01), míg más tényezők, beleértve a blaCITM és blaDHAM gének megszerzését, nem mutattak szignifikáns összefüggést a betegek életkorával (3. táblázat).

A klinikai minták közül a legtöbb AmpC β-laktamáz-termelő izolátumot (20,9%; 19/91) vérből és katétervégekből mutatták ki, ezt követte a vizelet (18,7%; 17/91), a genny (13,3%; 12/91) és a sebtampon (9,9%; 9/91). Hasonlóképpen, a legtöbb blaCITM és blaDHAM termelő izolátumot katétervégekből (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80) mutatták ki, majd vérből (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80) vizeletből (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) és gennyből (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80). Nem volt szignifikáns összefüggés a klinikai minták, az AmpC β-laktamáz termelés és a gének: blaCITM és blaDHAM között (3. táblázat).

Az AmpC β-laktamázok eloszlása és a blaCITM és blaDHAM gének megszerzése különböző Gram-negatív baktériumokban

Az AmpC β-laktamáz enzimek legnagyobb gyakoriságát az E. coli (28,6%; 26/91), majd a P. aeruginosa (26,4%; 24/91), az A. baumannii (13,2%; 12/91) és a K. pneumoniae (10,9%; 10/91) következett. A blaCITM és blaDHAM gének legnagyobb gyakoriságát az E. coli (30,6%; 25/82) (31,3%; 25/80), majd a P. aeruginosa (25,7%; 21/82), (22,5%; 18/80), az A. baumannii (12,2%; 10/82), (12,4%; 10/80) és a K. pneumoniae (10,9%; 9/82), (12,4%; 10/80) esetében mutatták ki (3. táblázat).

Diszkusszió

Az antimikrobiális rezisztencia növekvő előfordulása továbbra is az egyik legnagyobb közegészségügyi probléma a fejlődő országokban, például Nepálban29 , ami a kórházi tartózkodás meghosszabbodásához, a kezelési költségek növekedéséhez, a terápiás lehetőségek beszűküléséhez, valamint a megnövekedett morbiditáshoz és mortalitáshoz vezetett29,30 . A β-laktamázok termelése a fő védekező mechanizmus a β-laktám antibiotikumokkal szemben. Ezt a vizsgálatot azért végeztük, hogy feltárjuk a C osztályú β-laktamázok (AmpC) jelenlétét az ANIAS, Kathmandu, Nepál klinikai mintáiból származó Gram-negatív organizmusokban. A vizsgálat továbbá PCR-vizsgálattal értékelte az AmpC β-laktamáz gének (blaCITM és blaDHAM) előfordulását. Ezen enzimek és gének magas prevalenciáját találtuk, bár az ilyen enzimek előfordulása földrajzi régiónként, országon belül és országok között is eltérő volt.

Az 1151 klinikai mintából csak 253-ban (21,9%) mutatkozott jelentős organizmusszaporulat. Az összes (253) baktériumszaporulat több mint kilencven százaléka Gram-negatív baktérium volt, közülük az E. coli volt a legdominánsabb izolátum. Eredményeink összhangban vannak az Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 New Delhi, India,36 Al-Najaf City, Irak,37 Shashemene Referral Hospital, Etiópia,38 és Mexikóváros, Mexikó39 korábbi tanulmányokkal. A Gram-negatív bakteriális fertőzések kissé magasabb arányát figyelték meg a női betegek körében, ami a húgyúti fertőzések nagyobb gyakoriságának tudható be a nők körében. Ez összhangban van a Kathmandu-i Model Hospitalban17 és az indiai Andra-Pradeshben végzett korábbi vizsgálatokkal.40 Ezzel a vizsgálattal összhangban az indiai Uttar Pradesh államban végzett egyik tanulmányban a posztoperatív eseteknél a nőknél magasabb arányú gennyfertőzésről számoltak be (63,33%), mint a férfiaknál (43,75%).41

Ebben a vizsgálatban a Gram-negatív baktériumok izolátumai a következő antibiotikumokkal szemben mutattak nagyobb rezisztenciát: cefoxitin, ceftazidim, ciprofloxacin és cefepim, majd a cotrimoxazol, míg a meropenem, imipenem, piperacillin-tazobaktám és az azitromicin volt a legérzékenyebb antibiotikum. Hasonló mintázatot figyeltek meg a Chitwan Medical College, Chitwan,42 Padma Hospital, Pokhara korábbi eredményeiben.43 Az alacsony érzékenységi arányú cefoxitin és ceftazidim az első vonalbeli gyógyszerek, amelyeket a bakteriális enzimek könnyen hidrolizálnak, és kevésbé hasznosak a Gram-negatív kórokozók által okozott fertőzések kezelésében. A mi vizsgálatunkhoz hasonlóan az imipenem/meropenem volt a legérzékenyebb gyógyszer a korábbi, a katmandui Model Hospitalban,17 a spanyolországi Madridban,44 és az amerikai Wisconsinban végzett vizsgálatokban.45

Az antimikrobiális rezisztencia (AMR) az MDR növekvő terjedésével globális problémát jelent, és hatása nagyobb az alacsony és közepes jövedelmű országokban, ahol a fertőző betegségek terhei magasak.30 Az MDR-mikrobák kezelése költséges és nehézkes, amit tovább súlyosbít a nosokomiális fertőzések magas prevalenciája.46 Ebben a vizsgálatban az izolált Gram-negatív izolátumok közel fele (46,9%; 106/226) MDR-nek bizonyult. Az MDR baktériumok nagyobb gyakoriságáról számoltak be néhány más, Kathmanduban46-49 és Nepál más kerületeiben végzett vizsgálatból.15,50,51 Az ESBL, metallo β-laktamáz (MBL) vagy AmpC β-laktamáz termelése lehet az oka az újabb generációs antibiotikumokkal szembeni csökkent érzékenységnek.52 Az új generációs antibiotikumokkal szembeni csökkent érzékenységnek az oka. Ezenkívül a multidrog-rezisztencia a különböző gének rezisztens (R) plazmidokon való aggregációja és expressziója miatt alakul ki, vagy olyan gének miatt, amelyek multidrog efflux pumpákat kódolnak.53 Ezenkívül a β-laktamáz enzimek expressziójáért felelős gének folyamatosan társulnak a nem β-laktám antibiotikumokkal, például az aminoglikozidokkal és fluorokinolonokkal.

Ebben a vizsgálatban az AmpC termelés magasabb volt a férfi betegeknél (41,67%), mint a nőknél (38,98%). E vizsgálat eredményei összhangban vannak néhány más, az északnyugat-nigériai Kano városában végzett vizsgálatokkal.54 A mi eredményeink azonban eltértek a nigériai Beninben végzett vizsgálatoktól.55 A nők körében a multidrog-rezisztenciával járó UTI magasabb prevalenciájáról számos vizsgálat számolt be, ez az AmpC-termelő kórokozók magasabb prevalenciájának tudható be a nők körében, mivel ők hajlamosabbak az UTI-re, mint a férfiak.

A cefoxitin-rezisztencia használata a diagnosztikai laboratóriumokban megbízható szűrőanyagként/markerként szolgál az AmpC-termelés kimutatására. Ráadásul ez a marker jó negatív prediktív értéket biztosít.

A széleskörűségük ellenére egyes tanulmányok hangsúlyozták, hogy a cefoxitin használata rossz szűrőanyag az AmpC-termelésre. Ennek oka lehet az AmpC-n kívül más alternatív mechanizmusok létezése (ezek egyike a porin csatorna mutációja), ami hamis pozitív értelmezéshez (cefoxitin-rezisztenciaként) vezethet.52 Vizsgálatunkból kiderült, hogy a Gram-negatív izolátumok egyharmada (>40%) volt felelős az AmpC-termelésért. E vizsgálat eredményei ellentétben állnak a katmandui Model Hospitalban végzett vizsgálattal.17 A különbség oka lehet az ebben a vizsgálatban alkalmazott fenotípusos kimutatási módszer, amely a cefoxitin-rezisztencia tesztet és a cefoxitin (30µg) felhasználásával végzett AmpC lemezes tesztmódszert alkalmazta. Az alkalmazott megerősítő teszt a fenilboronsav teszt volt, amely a cefoxitin 30µg/400µg fenilboronsavat használta. A bóronsav-származékok az AmpC β-laktamáz enzimek reverzibilis inhibitorainak bizonyultak.56

Ebben a vizsgálatban 113 izolátumból 91 (80,53%) esetében figyeltek meg AmpC termelést. A mi vizsgálatunkban az AmpC-termelés aránya valamivel magasabb, mint más, a katmandui Model Hospitalból,17 Chitwan Medical College-ból,57 Bharatpurból, Chitwanból,58 és Indiából jelentett tanulmányoké.59

Az egyik módszerből adódó korlátok ellensúlyozása érdekében mindkét technika integrálása a rutin diagnosztikába növelheti a tesztek érzékenységét és specificitását a klinikai környezetben.

Az összesen 73 Gram-negatív izolátumban mind a blaCITM, mind a blaDHAM gének jelenlétét kimutatták. Ezek az eredmények összhangban vannak egy korábbi, az iráni Ilamból jelentett vizsgálattal.27 Az Indiából jelentett hasonló típusú vizsgálat azt mutatta, hogy a blaCITM gének gyakoribbak voltak az E. coliban.60 Vizsgálatunkban az AmpC-hez kapcsolódó gének (blaCITM és blaDHAM) előfordulását fenotípusos és genotípusos módszerekkel vizsgáltuk. Ez a tanulmány széleskörű elemzést nyújt az AmpC β-laktamáz termeléssel társuló Gram-negatív baktériumokról és antibiotikum-érzékenységi mintázatukról a klinikai izolátumok körében. E tanulmány eredményei fontosak a különböző organizmusok cefalosporinokkal szembeni rezisztencia-mintázatainak megismerésében. A β-laktamázzal járó multidrog-rezisztencia, beleértve az ESBL, MBL és AmpC termelést is, felügyeletére van szükség a rutinszerű klinikai gyakorlatban a kezelés optimalizálása és a β-laktám antibiotikumokkal szembeni további rezisztencia megelőzése érdekében.13,61,62.

Erősségek és korlátozások

Ez az első tanulmány, amely az AmpC β-laktamáz génjeit (blaCITM és blaDHAM) vizsgálja fenotípusos és molekuláris teszt segítségével egy nepáli tercier egészségügyi központban kezelt betegek körében. E tanulmány eredményei tájékoztathatják a tercier ellátóközpontok antimikrobiális politikáját, beleértve a kórházi fertőzések kezelésének, a kezelési protokollnak és a diagnosztikai eljárásnak az előkészítését. A tanulmánynak van néhány korlátja, amelyek közé tartozik a korlátozott AmpC β-laktamázok vizsgálata, a vizsgálat rövid időtartama és az, hogy egyetlen tercier ellátóközpontban végezték. A jövőbeli tanulmányok építhetnek rá, hogy több tercier ellátóközpontban végezzenek longitudinális vizsgálatot az összes β-laktamáz, például az ESBL, MBL, KPC és a rezisztenciáért felelős főbb gének feltárásával. Mindazonáltal, mint a fenotípusos és molekuláris módszereket trianguláló első ilyen típusú vizsgálat, ez a tanulmány értékes referencia lesz az AmpC β-laktamázokkal és a blaCITM és blaDHAM gének prevalenciájával kapcsolatos jövőbeli vizsgálatokhoz Nepál más helyszínein/kórházaiban.

Következtetés

Eredményeink azt mutatják, hogy a Gram-negatív izolátumok cefoxitinre való csökkent érzékenysége a plazmid-mediált AmpC gének jelenlétéhez kapcsolódik. Mivel nincs egyetlen végleges módszer, javasolt több fenotípusos kimutatási módszer egyidejű alkalmazása az AmpC β-laktamáz termelő baktériumok pontos kimutatására. Ebben a vizsgálatban a PCR az AmpC β-laktamáz gének (blaCITM és blaDHAM) közel 90%-át mutatta ki a fenotípusosan megerősített izolátumok között. A rezisztens gének és az MDR magas prevalenciája a Gram-negatív izolátumok körében riasztó jel, amely sürgős beavatkozási intézkedéseket tesz szükségessé ezen izolátumok növekedésének és terjedésének megfékezésére.