Lúgos foszfatáz izoenzim

A lúgos foszfatáz génszerkezete, fehérjekémiája és enzimológiája

Az ALP (ortofoszfor-monoészter foszfohidroláz, alkáli optimum, EC 3.1.3.1) az egész természetben megtalálható növényekben és állatokban (McComb et al., 1979). Az emberben négy ALP izoenzimet négy különálló gén kódol (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Az izoenzimek közül három alapvetően szövetspecifikus expresszióval rendelkezik, és ezeket bélrendszeri, placentáris és csírasejtes (placentaszerű) ALP-nek nevezik. A negyedik ALP izoenzim ubiquitikusan expresszálódik, ezért TNSALP-nek nevezik (Stigbrand és Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). A váz-, máj- és veseszövetek különösen gazdagok TNSALP-ben. A humán csontból, májból és veséből tisztított ALP-k megkülönböztető fiziko-kémiai tulajdonságai (hőstabilitás, elektroforetikus mobilitás stb.) a glikozidázokkal való érintkezés során elvesznek (Moss és Whitaker, 1985), ezért a TNSALP a “másodlagos” izoenzimek családját alkotja (a továbbiakban “izoformáknak” nevezem őket). Ugyanaz a gén kódolja őket, azonos polipeptidszekvenciával rendelkeznek, és csak a szénhidrátokat érintő poszttranszlációs módosításokban különböznek (Harris, 1980).

A TNSALP géntérképezési szimbóluma ALPL (“ALP-máj”), bár a TNSALP máj izoformájának funkciója nem ismert (lásd később). Az ALPL az 1. kromoszóma rövid karjának (1p36.1-p34) csúcsához közel helyezkedik el, míg a bél-, placenta- és csírasejt ALP-k génjei a 2. kromoszóma hosszú karjának (2q34-q37) csúcsán találhatók (Harris, 1990; Millán, 2006). Úgy tűnik, hogy az ALPL képviseli az ősi gént, míg a szövetspecifikus ALP-k valószínűleg génduplikációval alakultak ki (Harris, 1990). Az ALPL valamivel nagyobb, mint 50 kb, és 12 exont tartalmaz, amelyek közül 11-et transzlálnak az 507 aminosavmaradékból álló érett enzim kialakulásához (Weiss és mtsai., 1988b). A TATA és Sp1 szekvenciák szabályozó elemek lehetnek, de úgy tűnik, hogy a bazális expresszió “házőrző” promóterhatásokat tükröz, míg a különböző szövetekben történő differenciált expressziót egy poszttranszkripciós mechanizmus közvetítheti (Kiledjian és Kadesch, 1990). Az ALPL-nek két promótere és két megfelelő 5′-nem kódoló exonja van, az 1a és az 1b. Kifejeződésük két különböző mRNS-t eredményez, eltérő 5′-transzlálatlan régiókkal (Nosjean és mtsai., 1997). A transzkripció preferenciálisan az upstream promóterről (1a) történik az oszteoblasztokban és a downstream promóterről (1b) a májban és a vesében (Millán, 2006).

A szövetspecifikus ALP gének kisebbek, mint az ALPL, elsősorban a rövidebb intronoknak köszönhetően. A cDNS-ükből levezetett aminosav-szekvenciák 87%-os pozíciós azonosságot sugallnak a placentáris és a bél ALP között, de csak 50%-60%-os azonosságot a szövetspecifikus ALP-k és a TNSALP között (Harris, 1990).

A TNSALP aminosavmaradvány-szekvenciája öt lehetséges N-hez kötött glikozilációs helyet jelöl (Weiss és mtsai., 1988). Az N-glikoziláció szükséges a katalitikus aktivitáshoz. Az O-glikoziláció a csont, de nem a máj izoformáját jellemzi (Nosjean és mtsai., 1997).

2000-ben 1,8-Å felbontással megrajzolták a humán placentáris ALP kristályszerkezetét (Le Due és mtsai., 2000). A TNSALP aktív helye egy olyan nukleotidszekvenciából származna, amely az ALP-kben az egész természetben konzerválódott (Henthorn és Whyte, 1992), hat exont tükröz, és 15 aminosavmaradványból áll (Zurutuza és mtsai., 1999).

Az ALP-k Zn++-metalloenzimek (McComb és mtsai., 1979). A katalitikus aktivitáshoz azonos alegységekből álló multimer konfigurációra van szükség, ahol minden monomer egy aktív centrummal és két Zn++ atomtal rendelkezik, amelyek stabilizálják a tercier szerkezetet (Kim és Wycoff, 1991).

Az ALP-ket a vérkeringésben általában homodimereknek tekintik (McComb és mtsai., 1979). A TNSALP szimmetrikus dimer formában αβ topológiával rendelkezik mindkét alegység esetében, beleértve egy tízszálú β-lapot a középpontban (Hoylaerts és Millán, 1991). A szövetekben azonban az ALP-k a sejtfelszínekhez kötődnek (lásd később), talán homotetramerek formájában (Fedde és mtsai., 1988).

In vitro az ALP-k széles szubsztrátspecifikussággal és pH-optimummal rendelkeznek, amelyek a katalízisben részt vevő foszforvegyület típusától és koncentrációjától függnek (McComb és mtsai., 1979). A katalitikus aktivitáshoz Mg++ mint kofaktor szükséges (McComb et al., 1979). A PPi, valamint a foszforészterek hidrolizálhatók (Xu et al., 1991). A reakció egy szerin maradék foszforiláció-defoszforilációját foglalja magában. Úgy tűnik, hogy a kovalensen kötött Pi disszociációja a sebességkorlátozó lépés. A Pi valójában az ALP erős kompetitív inhibitora (McComb és mtsai., 1979; Kim és Wyckoff, 1991; Coburn és mtsai., 1998). Ugyanakkor az is lehet, hogy a Pi stabilizálja az enzimet (Farley, 1991).

Az ALP bioszintézisével kapcsolatban a magasabb szervezetekben továbbra is vannak bizonytalanságok. A humán ALP izoenzimek génszekvenciái azt mutatják, hogy a naszcens polipeptideknek van egy rövid, 17-21 aminosavmaradékból álló szignálszekvenciája (Harris, 1990) és egy hidrofób domén a karboxilvégződésükön (Weiss és mtsai., 1988b). Az ALP-k intracelluláris lebontásában proteaszómák is részt vehetnek (Cai és mtsai., 1998). Mindazonáltal ezek az ALP-k a plazmamembránok külső felszínéhez kapcsolódnak egy foszfatidil-inozitol-glikán rész poláris fejcsoportjához kötődve (Whyte és mtsai., 1988; Whyte, 1994), és a foszfatidil-inozitol-specifikus foszfolipáz által felszabadíthatók (Fedde és mtsai., 1988). A foszfatidilinozitollal való pontos kölcsönhatásuk azonban eltérhet az ALP izoenzimek között (Seetharam és mtsai., 1987).

A lipidmentes ALP a keringésben általában megtalálható rész. Mégis, az ALP sejtfelületekről történő felszabadulásának mechanizmusai nem ismertek. A folyamatban részt vehet egy C vagy D típusú foszfatidáz, detergensek hatása, proteolízis, membránfrakcionálás vagy lipolízis (Alpers és mtsai., 1990).

Az egészséges férfiak és nők esetében a szérumban vagy plazmában lévő ALP-aktivitás csaknem teljes egészében a TNSALP csont- és májizoformájának körülbelül azonos mennyiségéből származik (Millán és mtsai., 1980). Csecsemőknél és gyermekeknél, különösen újszülötteknél és serdülőknél magasabb a csont izoforma véráramszintje (McComb és mtsai., 1979). Egyes B és O vércsoportú egyéneknél, akik “szekretorok”, zsíros étkezés elfogyasztása után megnő a keringésben lévő kis mennyiségű bél ALP (Langman és mtsai., 1966; McComb és mtsai., 1979). Jellemzően azonban az intestinális ALP csak néhány százalékkal járul hozzá a szérum teljes ALP-aktivitásához (maximum 20%) (McComb és mtsi., 1979; Mulivor és mtsi., 1985). A placentáris ALP általában csak a terhesség utolsó trimeszterében fejeződik ki és kering (Birkett és mtsai., 1966). Különböző rákos megbetegedések azonban placentáris vagy csírasejtes (“placentaszerű”) ALP-t bocsátanak ki a véráramba (Millán, 1988). A keringő ALP kiürülése, mint sok más glikoprotein esetében is, valószínűleg a máj általi felvétel és lebontás (Young és mtsai., 1984).