ISH: in situ hibridizációs protokoll

A minta tárolása

RNS megőrzése
Az RNS megőrzését az RNáz enzim jelenléte nehezíti. Ez az enzim megtalálható az üvegeszközökön, a reagensekben, valamint a kezelőkön és ruházatukon. Az RNáz gyorsan elpusztítja a sejtben lévő RNS-t vagy magát az RNS-szondát, ezért a felhasználóknak biztosítaniuk kell, hogy steril technikákat, kesztyűt és oldatokat használjanak a szonda vagy a szöveti RNS RNáz-szennyeződésének megelőzése érdekében.

Általános mintatárolás fagyasztott metszetek használata esetén
A régebbi tárgylemezeken a legjobb eredmények érdekében ne tárolja a tárgylemezeket szárazon, szobahőmérsékleten. Ehelyett tárolja 100%-os etanolban -20°C-on, vagy szarufóliával lefedett műanyag dobozban -20°C-on vagy -80°C-on. Az ilyen tárolás több évig megőrzi a tárgylemezeket.

A szonda kiválasztása

RNS-szondák

Az RNS-szondáknak 250-1 500 bázis hosszúságúnak kell lenniük; a körülbelül 800 bázis hosszúságú szondák mutatják a legnagyobb érzékenységet és specificitást. A transzkripciós sablonoknak lehetővé kell tenniük mind a szonda (antisense szál), mind a negatív kontroll (sense szál) RNS-ek átírását. Ennek elérése érdekében klónozzuk ellentétes promóterekkel rendelkező vektorba. A kör alakú sablonokat a szonda elkészítése előtt linearizálni kell, bár PCR-sablonok is használhatók.

DNS-szondák

A DNS-szondák nagy érzékenységet biztosítanak az in situ hibridizációhoz. Az RNS-szondákhoz képest nem hibridizálnak olyan erősen a célzott mRNS-molekulákkal, ezért a hibridizáció utáni mosásokban nem szabad formaldehidet használni.

A szondaspecifikusság fontos. Ha a sejtben lévő mRNS vagy DNS pontos nukleotidszekvenciája ismert, pontos komplementer szonda tervezhető. Ha a bázispárok >5%-a nem komplementer, a szonda csak lazán hibridizál a célszekvenciához. Ez azt jelenti, hogy a szonda nagyobb valószínűséggel mosódik el a mosási és detektálási lépések során, és előfordulhat, hogy nem lesz megfelelően detektálható.

Digoxigenin (DIG)-jelölt RNS-szondás in situ hibridizációs protokoll

Ez a protokoll a DIG-jelölt egyszálú RNS-szondák használatát írja le a kívánt gén expressziójának kimutatására paraffinba ágyazott metszetekben.

1) Deparaffinizálás

Fagyasztott metszetek esetén kezdje a 2. lépésnél. Ha formaldehiddel fixált paraffinba ágyazott metszeteket használ, folytassa ezzel a lépéssel.

A folytatás előtt a tárgylemezeket deparaffinizálni és rehidratálni kell. A paraffin nem teljes eltávolítása a metszet rossz festését okozhatja.

Tegye a tárgylemezeket egy állványba, és végezze el a következő mosásokat:

• Xilén: 2×3 perc
• Xilén 1:1 100%-os etanollal: 3 perc
• 100%-os etanol: 2×3 perc
• 95%-os etanol: 3 perc
• 70 %-os etanol: 3 perc
• 50 %-os etanol: 3 perc
• Öblítsük le hideg csapvízzel

Tartsuk a tárgylemezeket a csapvízben az antigén visszanyerésig. Ettől kezdve a tárgylemezek nem száradhatnak meg, mivel ez nem specifikus antitestkötődést és magas háttérfestődést okoz.

2) Antigén-visszanyerés

Előmelegített 50 mM Trisben 20 µg/ml proteináz K-val 10-20 percig 37°C-on emészteni. Az inkubációs idő és a proteináz K koncentráció optimalizálást igényelhet.

Az optimális feltételek meghatározásához javasoljuk egy proteináz K titrálási kísérlet kipróbálását. Az elégtelen emésztés csökkenti a hibridizációs jelet, a túlzott emésztés pedig rossz szöveti morfológiát eredményez, ami nagyon megnehezíti a hibridizációs jel lokalizálását. Az optimális proteináz K koncentráció a szövet típusától, a fixálás hosszától és a szövet méretétől függően változik.

3) Öblítse a tárgylemezeket 5x desztillált vízzel.
4) Merítse a tárgylemezeket 20 másodpercre jéghideg 20%-os (v/v) ecetsavba. Ez permeabilizálja a sejteket, hogy a szonda és az ellenanyag hozzáférhessen.
5) Dehidratálja a tárgylemezeket 70%-os, 95%-os és 100%-os etanolban történő mosással, mosásonként kb. 1 percig tartó mosással, majd levegőn szárítsa meg őket.
6) Adjon 100 µl hibridizációs oldatot minden tárgylemezre.

Sóoldat (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Denhardt-oldat (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polivinil-pirrolidin)
• 10 g szarvasmarha szérum albumin (BSA)
• 10 g szarvasmarha szérum albumin (BSA)
• 500 ml steril dH2O

7) Inkubálja a tárgylemezeket 1 órán át párásított hibridizációs kamrában a kívánt hibridizációs hőmérsékleten. A tipikus hibridizációs hőmérséklet 55-62 °C között mozog.
8) Hígítsa a szondákat hibridizációs oldatban PCR-csövekben. Az RNS- vagy DNS-szonda denaturálásához melegítse 95°C-on 2 percig egy PCR-blokkban. Azonnal hűtsük le jégen, hogy megakadályozzuk az újraillesztést.
9) Csöpögtesse le a hibridizációs oldatot. Adjon hozzá 50-100 μL hígított szondát szelvényenként, a teljes mintát lefedve. Inkubáljuk a párásított hibridizációs kamrában 65 °C-on egy éjszakán át. Fedjük le a mintát fedőpapírral a párolgás megakadályozása érdekében.

Ez alatt a lépés alatt az RNS-szonda a megfelelő mRNS-hez, illetve a DNS-szonda a megfelelő sejtes DNS-hez fog hibridizálni. A hibridizációs hőmérsékletet a használt szonda szekvenciájától, valamint a sejt- vagy szövettípustól függően optimalizálja. Ezt a hőmérsékletet minden egyes elemzett szövettípusra optimalizálni kell.

A szondák optimális hibridizációs hőmérséklete a célszekvenciában jelen lévő bázisok százalékos arányától függ. A citozin és guanin koncentrációja a szekvenciában fontos tényező.

10) Szigorú mosások

Az oldat paraméterei, például a hőmérséklet, a só és a detergens koncentrációja manipulálhatók a nem specifikus kölcsönhatások eltávolítása érdekében.

1 L 20x sóoldatos nátrium-citrát (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g nátrium-citrát
• 800 mL steril dH2O
• Állítsuk be a pH-t 5-re citromsavval, töltsük fel 1 L-re és autoklávozzuk

Mossunk 1

• 50% formamidot 2x SSC-ben
• 3×5 percig, 37-45°C

Mossuk le a felesleges szondát és hibridizációs puffert magasabb hőmérsékleten (65°C-ig) rövid ideig. Ha túl sokáig hagyjuk, ez túl sokat moshat le a hibridizált szonda RNS/DNS-ből.

Mosás 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 perc, 25-75°C

Ez a lépés eltávolítja a nem specifikus és/vagy ismétlődő DNS/RNS hibridizációt.

Az alábbi irányelveket követve optimalizálja a hőmérsékletet és a sókoncentrációt a szigorított mosásokhoz:

• A nagyon rövid DNS/RNS-szondák (0.5-3 kb) vagy nagyon összetett szondák esetében a mosási hőmérsékletnek alacsonyabbnak kell lennie (legfeljebb 45°C-ig) és a szigorításnak alacsonyabbnak (1-2x SSC).
• Egy-lókuszú vagy nagyméretű szondák esetében a hőmérsékletnek 65°C körül kell lennie és a szigorításnak magasnak (0 alatt.5x SSC).
• A hőmérsékletnek és a szigornak a legmagasabbnak kell lennie ismétlődő szondák (például alfa-szatellita ismétlődések) esetében.

11) Mossunk kétszer MABT-ben (Tween 20-t tartalmazó maleinsav pufferben) 30 percig szobahőmérsékleten. A MABT kíméletesebb, mint a PBS, és alkalmasabb a nukleinsavak kimutatására.

Az 5x MABT törzs készítéséhez

• 58 g maleinsav
• 43,5 g NaCl
• 55 g Tween-20
• 900 ml víz

A pH-t 7,5-re állítjuk Tris bázis hozzáadásával. Körülbelül 100 g-ra lesz szükség. Hozza a végső térfogatot 1 literre.

12) Szárítsuk meg a tárgylemezeket.
13) Vigye át párásított kamrába, és adjon 200 µl blokkoló puffert minden egyes metszethez (MABT + 2% BSA, tej vagy szérum). Blokkoljuk 1-2 órán át szobahőmérsékleten.
14) Csöpögtesse le a blokkoló puffert. Adja hozzá az antijelölő antitestet a szükséges hígításban a blokkoló pufferben. Az ajánlott koncentráció/hígításért nézze meg az antitest adatlapját. Inkubáljuk 1-2 órán át szobahőmérsékleten.
15) Mossuk a tárgylemezeket 5×10 percig MABT-vel szobahőmérsékleten.
16) Mossuk a tárgylemezeket 2×10 percig szobahőmérsékleten egyenként előfestő pufferrel (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17). A fluoreszcencia detektálásához folytassuk a 18. lépéssel. A detektálás egyéb formái esetén tegye vissza a tárgylemezeket a párásított kamrába, és kövesse a gyártó utasításait a színfejlődéshez.

18) Öblítse át a tárgylemezeket desztillált vízzel.
19) Szárítsa a tárgylemezeket levegőn 30 percig. Mosson 100%-os etanollal, és alaposan szárítsa meg levegőn.
20) Szerelje fel a DePeX rögzítő oldattal.