Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology

A spóraköpenyek fehérjékből állnak, protomerikus alegységek rendezett elrendezésével rendelkeznek, önszerveződést mutatnak és védő tulajdonságokkal rendelkeznek . Mint szunnyadó, metabolikusan inaktív életformák, a spórák korlátlan ideig fennmaradhatnak kiszárított állapotban, és valóban dokumentálták, hogy évmilliókig sértetlenül fennmaradnak . A spórák képesek ellenállni a 90°C-os hőmérsékletnek, valamint a káros vegyi anyagoknak való kitettségnek . A legtöbb (de nem minden) spóraképző baktérium két fő nemzetségbe, a Bacillus és a Clostridium nemzetségbe tartozik. A Clostridia spóraképzők a Bacillustól eltérően csak anaerob körülmények között differenciálódnak, így a Bacillus a legjobban tanulmányozható nemzetség.

A Bacillus fajok egyetlen spórát vagy endospórát (szemben a gombák exospórájával) hoznak létre a baktériumsejtben egy differenciálódási folyamat révén, amely több száz fejlődési gén összehangolt működését igényli. Az érett spórák jellemzően 0,8-1,2 μm hosszúak és gömb vagy ellipszoid alakúak (lásd az 1A ábrát). Az egyetlen bakteriális kromoszóma a spóra középpontjában, az úgynevezett magban tömörül. A spóramagot lipidmembrán és módosított peptidoglikán rétegek veszik körül, de a legfontosabb szerkezet a spóraköpeny. Ez a réteges fehérjeburok biztosítja a spóra ellenállását a szerves oldószerekkel és a lizozimmal szemben. A Bacillus subtilisben akár 25 különböző burokfehérje is jelen van két különböző burokrétegben (1B. ábra), a belső és a külső burokban, de más fajoknál bizonyíték van arra, hogy a burok kevésbé összetett, és egyes esetekben csak néhány fehérjetípusból állhat. A spóraköpeny szerkezete és összeszerelése mostanában a fág T4 összeszerelésének klasszikus vizsgálataihoz hasonlóan a komplex morfogenetikai összeszerelési folyamatok megértésének modellrendszereként jelenik meg. A B. subtilis burok külső, elektrondús rétege 5 fő polipeptidből áll: CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) és CotF (8 kDa). A CotA egy több rézből álló oxidáz, és multimer formában felhalmozódhat (mikroszkóposan megfigyelhető) a sporuláló sejteken belül egyes köpeny-defektív mutánsokban. Feltehetően a CotA oligomerizációja és önszerveződése megelőzi a spóraköpeny felszínére történő lerakódást. A CotG és a CotB fehérjékről is kimutatták, hogy kovalens kölcsönhatásba lépnek egymással, továbbá a CotG és a CotC rendkívül szokatlan aminosav szekvenciákkal rendelkezik, amelyek többszörös, 12-13 aminosavból álló, lizinekben és tirozinokban gazdag ismétlődéseket (>13) tartalmaznak. Ezenkívül számos spóraköpeny-fehérje szokatlan profilú, azaz multimer formájú és rendellenes molekulatömegű, amikor SDS-PAGE-vel vizsgálják. A közelmúltban kimutatták, hogy a spóraköpeny valójában rugalmas, és képes tágulni és összehúzódni, és ez a tulajdonság kritikus a spóraképződéshez, amikor a spóra kiszárad, és hasonlóan a csírázáshoz, amikor a spóra rehidratálódik. Az önszerveződő struktúrának ez az aspektusa különösen érdekes, és számos jövőbeli alkalmazást kínálhat a gyógyszeradagolás, a nanofabrikálás és a felületi bevonatok terén.

Bakteriális endospórák. Az A panel B. subtilis endospórákat mutat, amelyek közül az egyik még mindig a pálcika alakú “anyasejtben” van. A B. subtilisben a spórák körülbelül 1,2 μm hosszúak és ellipszoid alakúak. A szabaddá vált spóráknak egy átlátszó védőburkolata van, amelyet spóraköpenynek nevezünk, és amely akár 25 különböző protomer komponensből áll, amelyek különálló rétegekbe rendeződnek. A B panel a szolubilizált spóraköpeny fehérjéinek tipikus SDS-PAGE (12,5%) frakcionálását mutatja, amely feltárja a domináns fajokat.

A baktérium spóraköpeny szerkesztése

A közelmúltban jelent meg egy stratégia a Bacillus subtilis spórák szerkesztésére, hogy heterológ antigéneket jelenítsenek meg a spóra felszínén, amelyet a 2. ábra szemléltet. A spóraalapú display rendszer számos előnyt kínál a baktériumsejtek felhasználásán alapuló rendszerekkel szemben, ezek közé tartozik a baktériumspóra robusztussága, amely lehetővé teszi a kiszárított formában történő tárolást, az egyszerű előállítás, a biztonság és a genetikai manipuláció széleskörű eszközeivel támogatott technológiai platform.

Spórafelületi display spóraköpeny fehérjék felhasználásával. A B. subtilis spóra egy belső magból (sárga) áll, amelyet egy peptidoglikánszerű kéreg (piros színnel) és egy fehérjebevonatú köpeny vesz körül, amely egy belső (zöld) és egy külső (fekete) részre oszlik. A fúziós fehérje, amely egy hordozó (kék) és egy utas (lila) részből áll, a spóra felszínén van kitéve.

Azzal szemben, hogy rengeteg információ áll rendelkezésre arról, hogy a génexpresszió hogyan szabályozza a növekvő sejt nyugvó spórává történő differenciálódását, keveset tudunk a fehérjék bevonatba való beépülésének mechanizmusairól, a bevonat legkülső részét alkotó szerkezeti összetevők természetéről és arról, hogy vannak-e horgonyzó motívumok. A heterológ fehérjéknek a spóra felszínén történő expozíciójára irányuló kezdeti kísérletek két köpenykomponensre, a CotB-re és a CotC-re összpontosítottak. A CotB esetében ismert, hogy ez a spóraköpenyfehérje felszíni elhelyezkedésű, míg a CotC esetében a többi köpenyfehérjéhez képest ez a faj nagy relatív gyakorisággal fordul elő . A CotB és a CotC mint potenciális hordozófehérjék kiválasztásának további pozitív jellemzője volt az a megfigyelés, hogy mindkét köpenykomponens nélkülözhető a látszólag normális spóra kialakulásához és csírázásához.

A spóra felszínén megjelenítendő modellfehérjéként kezdetben két antigént választottak ki: i) a tetanusztoxin (TTFC) nem toxikus 459 aminosavból álló C-terminális fragmentumát, amely egy jól jellemzett és erősen immunogén 51 .8 kDa peptid, amelyet a Clostridium tetani tetC génje kódol; és ii) az Escherichia coli enterotoxikus törzseinek hőlabilis toxinjának (LTB) 103 aminosavas B alegysége, egy 12 kDa peptid, amelyet az eltB gén kódol.

CotB mint hordozófehérje

A többi köpenykomponenshez hasonlóan a CotB-t is a külső köpenyréteghez társították genetikai bizonyítékok alapján, és csak a közelmúltban egy intakt spórákon végzett immuncitofluorimetriás elemzés kimutatta, hogy a CotB hozzáférhető a CotB-specifikus antitestek számára, és ezért valószínűleg a spóra felszínén van kitéve .

A CotB szerkezeti gén, a cotB, a σK és a GerE DNS-kötő fehérje kettős transzkripciós kontrollja alatt áll. Ennek következtében a cotB csak a sporuláló sejt anyasejt kompartmentjében íródik át . Miután az anyasejt citoplazmájában szintetizálódott, a CotB a CotE, CotG és CotH függvényében épül össze a képződő spóra körül. Ezért a CotB és a végül hozzá fuzionált heterológ fehérje nem megy át a sejtfal transzlokációs lépésen, ami más baktériumok display rendszereire jellemző.

A CotB erősen hidrofil C-terminális fele három 27 aminosav-ismétlésből áll, amelyek szerin-, lizin- és glutaminmaradékokban gazdagok. A szerinmaradékok a CotB C-terminális felének több mint 50%-át teszik ki. A CotB ismétlődések lizin-maradványai a kötőszöveti fehérjék, a kollagén és az elasztin analógiájára a molekulán belüli vagy molekulák közötti keresztkötés helyeit képviselik. A CotB fehérje levezetett molekulatömege 46 kDa, de SDS-PAGE-n 59 kDa polipeptidként vándorol. A közelmúltban a mért és a levezetett molekulatömeg közötti eltérést azzal magyarázták, hogy kimutatták, hogy a CotB eredetileg 46 kDa-s fajként szintetizálódik, majd 59 kDa-s homodimerré alakul át, amely megtartja mind az N-, mind a C-terminális végeket, amelyeket a cotB nukleotidszekvencia alapján jósolnak.

A rekombináns B. subtilis spórák felületén CotB-TTFC-t vagy CotB-LTB-t expresszáló spórák előállítása (i) a cotB gén és promóterének felhasználásán alapult a transzlációs fúziók létrehozásához és (ii) a cotB-tetC és cotB-eltB génfúziók kromoszómális integrálásán a nem esszenciális amyE gén kódoló szekvenciájába (3A ábra) . A fúziós fehérjék cotB transzkripciós és transzlációs jelek alá helyezése biztosította a sporuláció alatti expresszió helyes időzítését, míg a kromoszómális integráció garantálta a konstrukció genetikai stabilitását. Mivel nem állt rendelkezésre elegendő információ a CotB köpeny összeszereléséről és a lehorgonyzó motívumokkal szemben támasztott követelményekről, a kezdeti kísérletek során az utasfehérjét a CotB C-terminálisán, N-terminálisán vagy közepén helyeztük el (3B. ábra).

Spórusfelszíni display rendszer B. subtilisben . (A) A génfúziók kromoszómára történő integrálásának sematikus ábrázolása. A piros sávok a génfúziót, a szürke és zöld sávok az integrációs helyként használt B. subtilis nem esszenciális amyE génjét, illetve a szelektálható markerként használt klóramfenikol-acetiltranszferáz (cat) génjét jelölik. (B) A fúziós fehérjék sematikus ábrázolása teljes hosszúságú CotB (380 aminosav) vagy CotBΔ105 (275 aminosav) vagy CotC (66 aminosav) mint hordozófehérje felhasználásával (mind kék színnel). A teljes hosszúságú CotB három 27 aminosavból álló ismétlődése és a CotBΔ105-ben megmaradó részük fekete színnel van jelölve. A lila sávok a fúziók heterológ részét (TTFC vagy LTB) jelölik.

Amikor a TTFC-t és az LTB-t a CotB C-terminális végéhez fuzionáltuk, a kiméra fehérjék nem tudtak megfelelően összeállni a spóra felszínén (Isticato és Ricca, nem publikált). Az ilyen kezdeti kudarcokat a konstrukciók esetleges instabilitásának tulajdonították, akár DNS-szinten (ismétlődő DNS-szekvenciák), akár fehérjeszinten. Az ilyen problémák megkerülése érdekében a TTFC-t és az LTB-t a három 27 aminosavismétlődéstől mentesített CotB-forma, a CotBΔ105-TTFC C-terminális végéhez fuzionálták (3A ábra). A teljes hosszúságú változattal ellentétben a CotBΔ105-TTFC kiméra fehérje megfelelően összeállt és exponálódott a spóra felszínén . A kvantitatív dot blot kimutatta, hogy minden egyes rekombináns spóra 0,00022 pg CotBΔ105-TTFC fúziós fehérje mennyiséget tett ki, ami arra enged következtetni, hogy 1,5 × 103 kiméra molekula van jelen minden egyes rekombináns spóra felületén.

A CotBΔ105-TTFC-vel ellentétben a CotBΔ105-LTB nem állt össze megfelelően. Az ezt a kimérát expresszáló törzs csökkent sporulációs és csírázási hatékonyságot mutatott, és spórái nem voltak rezisztensek a lizozimmal szemben. Ezek a megfigyelések, valamint a felszabadult köpenyfehérjék SDS-PAGE analízise arra utalt, hogy a CotBΔ105-LTB jelenléte erősen megváltoztatta a spórák köpenyrétegét. Egy in-silico elemzés némi homológiát mutatott a kiméra termék (a fúziós régióban) és a LytF, a B. subtilis által a vegetatív növekedés során termelt sejtfal-asszociált endopeptidáz között, így felmerült annak lehetősége, hogy a kiméra termék egyes köpenykomponensek lebontásával zavarhatja a megfelelő köpenyképződést (Mauriello és Ricca, adat nem látható).

A fent leírt C-terminális végi fúzió mellett a modell utasfehérje TTFC-t a CotB N-terminálisánál és közepén is fuzionáltuk (3B ábra). Mindkét esetben a CotBΔ105 formáját használtuk, hogy elkerüljük a C-terminális fúzióval tapasztalt problémákat (lásd fent). Mind az N-terminális, mind a szendvicsfúzióból olyan kiméra termékek keletkeztek, amelyek mind minőségi, mind mennyiségi szempontból megfelelően illeszkedtek a köpenyszerkezetbe . Legalábbis a CotB esetében ezután arra lehetett következtetni, hogy ahol az utasfehérje exponálva van, ott nem befolyásolja a spóra felszínén való megjelenést.

CotC mint hordozófehérje

A CotC a B. subtilis spóraköpeny 12 kDa-os, lúgban oldódó komponense, amelyet korábban reverz genetikával azonosítottak, majd genetikai bizonyítékok alapján a külső köpenyréteghez társítottak . A CotC-t kezdetben hordozójelöltnek tekintették, mivel viszonylag nagy mennyiségben van jelen a burokban (1B. ábra). A CotG-vel és a CotD-vel együtt a CotC az összes szolubilizált köpenyfehérje mintegy 50%-át képviseli. Ez a viszonylag nagy mennyiség lehetővé tenné jelentős számú CotC-alapú kiméra összeállítását a burokban, így biztosítva a hatékony heterológ megjelenítést. A cotC gén expressziója az anyasejt-specifikus σ-faktor σK és a GerE és SpoIIID transzkripciós regulátorok kontrollja alatt áll. A CotB-hez hasonlóan a CotC is az anyasejtben íródik át, és a burokba való beépülése nem igényel membrántranszlokációt. A cotC gén elsődleges terméke egy 66 aminosavból álló polipeptid, amely rendkívül gazdag tirozin (30,3%) és lizin (28,8%) maradékokban . A közelmúltban azonban kimutatták, hogy a CotC legalább négy különböző fehérjeformává áll össze, amelyek mérete 12 és 30 kDa között változik . Ezek közül kettő, amelyek molekulatömege 12 és 21 kDa, és amelyek valószínűleg a CotC monomer, illetve homodimer formájának felelnek meg, közvetlenül a szintézisük után nyolc órával, a sporuláció kezdete után rakódnak össze a képződő spórán. A másik két forma, a 12,5 és a 30 kDa, valószínűleg a két másik forma poszttranszlációs módosításainak termékei, amelyek a spóra érése során közvetlenül a köpeny felszínén keletkeznek.

A CotC esetében eddig csak C-terminális fúziókat sikerült létrehozni (3B ábra). Mind a CotC-TTFC, mind a CotC-LTB génfúziókat úgy nyertük, hogy a tetC-t vagy az eltB-t az utolsó cotC kodonnal egy keretben klónoztuk a cotC promóter régió transzkripciós és transzlációs kontrollja alatt. A génfúziót ezután kettős cross-over rekombinációval integráltuk a B. subtilis kromoszómába az amyE lokuszon (3A. ábra). Mindkét kiméra fehérje a rekombináns spórák köpenyére épült fel anélkül, hogy a spórák szerkezetére és/vagy működésére jelentős hatást gyakorolt volna, mivel a sporuláció és a csírázás hatékonysága, valamint a rezisztencia tulajdonságai tekintetében a vad típusú spórákkal azonosnak tűntek. A Western blot, a citofluorimetriás elemzés és a CotC-TTFC esetében az immunfluoreszcens mikroszkópia (4. ábra) kimutatta, hogy mindkét CotC-alapú kiméra megjelent a rekombináns spórák felszínén. A B. subtilis spórákon exponált rekombináns fehérjék mennyiségi meghatározása kimutatta, hogy kb. 9,7 × 102, illetve 2,7 × 103 CotC-TTFC és CotC-LTB molekula került ki minden spórából.

A CotC-LTB és CotC-TTFC jelenlétének kimutatása immunfluoreszcens mikroszkópiával. A B. subtilis törzsek sporulációját a reszuszpenziós módszerrel indukáltuk, és a mintákat 6 órával a sporuláció kezdete után vettük, majd immunfluoreszcens mikroszkópiával elemeztük a korábban leírtak szerint . A mintákat egér anti-LTB antitesttel, majd anti egér IgG-TRITC konjugátummal (vörös fluoreszcein, A & B panelek), vagy nyúl anti-TTFC antitesttel, majd antinyúl IgG-FITC konjugátummal (zöld fluoreszcein, C & D panelek) jelölték. A & C panel, vad típusú spórák; B panel, CotC-LTB-t expresszáló izogén spórák); D panel, CotC-TTFC-t expresszáló izogén spórák.

Bár a CotC nagyobb mennyiségben jelenik meg, mint a CotB a köpenyen belül, a heterológ fehérjék hasonló mennyiségét tárja fel a CotC-alapú és a CotBΔ105-alapú rendszer. Ez az eredmény némileg váratlan volt, mivel a CotC sokkal nagyobb mennyiségben fordul elő, mint a CotB a burokban. Egy lehetséges magyarázat abból a közelmúltbeli felfedezésből származik, hogy a CotC C-terminális vége nem csak a többi CotC molekulával, hanem más köpenykomponensekkel való kölcsönhatáshoz is elengedhetetlen (Isticato és Ricca, kézirat előkészítés alatt), és ezért azt mutatja, hogy a CotC hordozóként való használatát még optimalizálni kell.

A spórában megjelenített fehérjék stabilitása

A baktériumspóra mint kedvező megjelenítési rendszer használatának egyik fő oka annak jól dokumentált stabilitása. A spórák hosszú ideig egyszerűen tárolhatók szobahőmérsékleten anélkül, hogy ellenálló- és stabilitási tulajdonságaik romlanának. Ez rendkívül hasznos tulajdonság lenne számos biotechnológiai alkalmazásban. Például, ha az utasfehérje egy antigén, a rekombináns spóra ideális hőstabil orális vakcinává válhatna a fejlődő országokban történő felhasználásra, ahol a hőstabilitás a rossz elosztás és tárolás miatt a legnagyobb gondot jelenti.

Míg azonban a spóra stabilitása jól dokumentált, a spóra felületén exponált heterológ fehérjék stabilitását csak a közelmúltban vizsgálták. A CotBΔ105-TTFC-t (lásd fentebb) expresszáló spórákat és a szülői spórákat -80°C-on, -20°C-on, +4°C-on és szobahőmérsékleten tárolták, és különböző tárolási idők mellett 12 hétig vizsgálták. A rekombináns spórák felületén jelen lévő heterológ fehérje mennyisége minden esetben azonosnak tűnt a frissen készített és a 12 hétig tárolt spórák között (5. ábra). Ezek az eredmények, amelyek azt mutatják, hogy a heterológ fehérjék stabilan exponálhatók a rekombináns spórák felszínén, megerősítik a spóraalapú rendszert, mint egy nagyon ígéretes megjelenítési megközelítést, amely leküzdheti más rendszerek néhány hátrányát, és amely számos különböző biotechnológiai területen találhat alkalmazást.

A vad típusú spórákból és a CotBΔ 105 -TTFC kimérát exponáló spórákból kivont fehérjék dot blot analízise. A CotBΔ105-TTFC kimérát expresszáló frissen tisztított spórákat (t0) vagy 4, 8 vagy 12 hetes (t4, t8 és t12) szobahőmérsékleten történő tárolás után (t4, t8 és t12) vizsgáltuk a spóraköpenyből extrahált fehérjék dot blotolásával. A tisztított TTFC (nanogrammban) és a köpenyfehérjék (mikrogrammban) koncentrációját tüntettük fel. A fehérjéket monoklonális anti-TTFC antitestekkel (Boeringher), majd foszfatáz-konjugált másodlagos antitestekkel töltöttük fel és reagáltattuk. Hasonló intenzitású jeleket kaptunk frissen tisztított spórákkal és 12 hétig szobahőmérsékleten tárolt spórákkal.

A szájon át történő vakcinázás elvi bizonyítéka a tetanusz mint modellbetegség felhasználásával

A CotBΔ105-TTFC-t expresszáló spórákat egerek orális úton történő immunizálására használták . A szérum IgG és a széklet sIgA egyértelmű szerokonverziót mutatott a TTFC-vel szemben. Az adagolási séma háromszor három adagot (1,67 × 1010) alkalmazott 5 hét alatt, és az orális immunizáláshoz optimalizált rendszereken alapult. A TTFC-specifikus IgG-titerek 33 nap elteltével (>103) azt sugallták, hogy ezek védőszintet értek el, és a 10 LD50-nek megfelelő tetanusztoxinnal megfertőzött egerek teljesen védettek voltak. A 20 LD50-es dózissal megfertőzött nyolc egérből hét maradt életben, ami arra utal, hogy ez volt a védettség küszöbértéke. Hasonló vizsgálatot végeztek CotB-TTFC spórákkal történő orrimmunizálással, de alacsonyabb dózissal és három immunizálással. Itt a TTFC-specifikus IgG-válaszok alacsonyabbak voltak, de még mindig szerokonverziót mutattak. Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy a heterológ antigént kifejező mesterséges spórák felhasználhatók védőimmunizálásra. Továbbá, bár a nyálkahártya-válaszok nem fontosak a Clostridium tetani (szisztémás kórokozó) elleni védelem szempontjából, nyilvánvalóan fontosak a nyálkahártya-kórokozók esetében. További vizsgálatokra lesz szükség az adagolási rendszerek optimalizálásához (kevesebb dózis és kevesebb spóra), de ezek a korszakalkotó vizsgálatok megnyitották az utat a specifikus nyálkahártya-kórokozók elleni fejlesztés előtt. Bár ezek a vizsgálatok biztatóak és humorális válaszokat mutatnak, még nincs egyértelmű bizonyíték a sejtválaszokra. Kimutatták azonban, hogy a spórák disszeminálódnak a GALT-ba, és megtalálhatók a Peyer-foltokban (PP) és a mesenteriális nyirokcsomókban . A spóra kis mérete (1 μm) lehetővé teszi, hogy az M-sejtek felvegyék és a PP-be szállítsák, ahol kölcsönhatásba léphet az antigénprezentáló sejtekkel. A kezdeti vizsgálatok azt mutatták, hogy a spórák képesek csírázni és rövid ideig megmaradni a bél makrofágjaiban, valamint in vivo Th 1 citokineket, például IFN-γ-t kiváltani.