Apoenzim

5.11.3 A fehérje szerepe – kölcsönhatások az enzim, a koenzim és a szubsztrát között

A koenzim minden esetben az apoenzimhez kötődik anélkül, hogy az abszorpciós spektrum alapvetően megváltozna. Ez a megfigyelés arra utal, hogy az enzim nem torzítja el a korringyűrűt az alapállapotú oldati konformációjától. A koenzim-fehérje komplex UV-látható abszorpciós spektrumából azonban nem nyerhető információ az α-tengelyű ligandum azonosságáról. Vizsgálatok kimutatták, hogy az α-tengelyes 5,6-dimetilbenzimidazol ligandumot legalább három kobalaminfüggő enzimben: metionin-szintáz,4,7 metilmalonyl-CoA-mutáz,8,45,46 és glutamátmutáz,47 a megfelelő fehérje hisztidin-oldalláncával helyettesítik. Ezzel szemben a kobalaminból származó 5,6-benzimidazol ligandum még mindig az α-tengelyű ligandum pozícióját foglalja el a diol-dehidrázhoz48 és a ribonukleotid-reduktázhoz kötött AdoCbl-ben (lásd 5.08. fejezet).

A hisztidin oldallánc koordinációjának befogadásához az 5,6-dimetilbenzimidazol bázis, a ribofuranozil-foszfodiészter és a propionamid oldallánc “nukleotid hurokjának” el kell lengenie a korringyűrűtől, és be kell illeszkednie a fehérjén belüli kötőzsebbe. A DxHxxG konszenzus szekvenciát olyan kobalaminfüggő enzimekben azonosították, amelyek az α-tengelyű ligandumot hisztidin oldallánccal helyettesítik.7,49,50 A kobaltatomhoz koordinálódó hisztidin minden bizonnyal hidrogénkötésen keresztül lép kölcsönhatásba az aszpartátmaradvánnyal. A koordináló ligandum szerepén túlmenően a His/Asp kettős pontos funkciója, mint az enzimaktivitás modulátora, még nem tisztázott.49 Az aktív centrum más maradékai is részt vehetnek egy kiterjedt hidrogénkötés-hálózatban a fémcentrum reaktivitásának szabályozására.7 7

Adenozil-kobalamin-függő enzimeknek legalább 1012-szeresére kell növelniük a CoC kötés homolízisének sebességét, hogy elérjék a katalízis megfigyelt sebességét.14 Az adenozil-kobalamin labilizálása a CoC kötés gyengítését követeli meg a homolitikus hasadás lehetővé tételéhez. Bár a kobalaminfüggő enzimekben nem bizonyított koncepció, a CoC kötés torzításához (gyengítéséhez) elegendő energia könnyen származhat a többlet kötési energia felhasználásából, amely a kobalamin kofaktorral való többszörös hidrogénkötéses kölcsönhatásokból származik, beleértve a korrin gyűrűt díszítő amid oldalláncokat.51 Az amid oldalláncok a nem enzimatikus kobalamin transzkobalamin, haptokorrin és intrinsic faktor transzkobalamin transzportfehérjékhez való kötődésének fontos felismerő elemei is.52 Az egyes amid oldalláncok eltávolítása vagy kémiai derivatizálása 3-40-szeresére változtatja a transzkobalaminhoz való kötődést52 , a c-amid oldallánc teljes eltávolítása pedig lehetővé teszi egy további kettős kötés bevezetését a makrociklusos vázba, ezáltal a korringyűrű ellaposodik, ami az abszorpciós maximum vörös eltolódásával jár.53

A kívánt reakció elősegítése mellett az adenozil-kobalamin-függő enzimek egy második fontos funkciót is ellátnak azáltal, hogy megakadályozzák a nemkívánatos mellékreakciókat, amelyek gyakran kísérik a radikális reakciókat.54 A negatív katalízis54 e funkciója erősen korlátozott szabad energiafelületet igényel, amelyet egy mély kanyonként képzelhetünk el, amelyen keresztül a reakció a szabad energiafelület mentén halad. Ennek a kanyonnak meredek falakkal kell rendelkeznie, hogy megakadályozza a mellékreakciókat és korlátozza a nagy reakcióképességű radikális köztes terméket. A reakciósorozat végén a radikális köztiterméket az 5′-deoxi-adenozil gyök és a kob(II)alamin rekombinációja oltja ki, ezáltal regenerálva az adenozil-kob(III)alamin kofaktor alapállapotát (nyugalmi állapotát). Ha az enzim 25 kcal mol-1 energiát fordít a C-Co kötés homolízisének elősegítésére a katalitikus ciklus megkezdéséhez, akkor ezt az energiát a reakciósorozat végén vissza kell nyernie. Az energia visszanyerése nem lenne lehetséges, ha az átrendeződések nemkívánatos sorozata olyan gyök keletkezne, amely termodinamikailag stabilabb, mint az 5′-deoxi-adenozil gyök. Ezért az enzimnek meg kell akadályoznia, hogy az alkilgyök átrendeződjön egy alacsony energiájú köztitermékké, vagy a fehérjeállványzaton keresztül vándorolva egy stabil gyököt képezzen, amely nem tud részt venni a katalízisben.55

A paramágneses species nem alakul ki, amíg az enzim-szubsztrát komplexben az összes reakciókomponens jelen van, mivel a koenzimből származó gyök kialakulása szubsztrát hiányában nem kívánt mellékreakciókhoz vezethet. A metilmalonyl-CoA mutázzal végzett EPR-kísérletek46,55 megerősítik, hogy a CoC kötés homolízise csak a szubsztrát hozzáadása után következik be, amit a termékszerű EPR-jel megjelenése jelez.46 Hasonlóképpen, az etanolamin-ammónia-liázzal végzett stop-flow spektrofotometriás kísérletek azt mutatják, hogy a kob(II)alamin jele csak az enzim és a koenzim telítő szubsztrátmennyiséggel való kombinációja után jelenik meg a látható spektrumban.56-59

Az adeno-szilcobalamin CoC kötésének fotolízise, termolízise és enzim által elősegített homolízise a kob(II)alaminból és az 5′-deoxi-adenozil gyökből álló szingulett gyökpárt eredményez.60,61 Mivel mindezen folyamatok ugyanazon gyökpár kialakulásához vezetnek, a fotolízis vizsgálatok reakciódinamikájából származó információk kapcsolatba hozhatók a javasolt enzimatikus reakciómechanizmusokkal. Az adenozil-kobalamin fotohomolízise a korringyűrű elektronikus π → π* promóciójával kezdődik, és a CoC kötés homolíziséhez vezető úton egy köztes töltésátadási állapotot kell tartalmaznia.60,61 Az adenoszil-kobalaminnal végzett pikoszekundumos fotolízis vizsgálatok 109 s-1 geminát gyökpár rekombinációs sebességet mutatnak, a ketrec rekombinációs hatékonysága (Fc) körülbelül 94%.42,62-64 A kobalaminokkal végzett nanoszekundumos és folyamatos hullámú fotolízis vizsgálatok megerősítik a hatékony gyökpár rekombinációt a geminát ketrecben, az adenoszil-kobalamin esetében körülbelül 20%-os, a metil-kobalamin esetében 35%-os teljes fotokémiai kvantumhozammal.65,66 Enzim hiányában a geminát gyökpárok nagy része rekombinálódik, mielőtt jelentős diffúziós szétválás következne be. Az 5′-deoxi-adenozil gyök stabilizálásához és a katalízis elősegítéséhez az enzimnek növelnie kell a gyökpárok elválasztási távolságát, valószínűleg konformációs változáson keresztül. Bármi legyen is a mechanizmus, a geminát rekombináció nagy sebessége a gyökpárban megköveteli, hogy az enzim egyik funkciója a gyökök szétválasztása vagy az egyik gyök átmeneti csapdába ejtése legyen az idő előtti rekombináció megakadályozása érdekében.

Bár a keletkező szingulett {5′-deoxi-adenozil gyök:kob(II)alamin} gyökpárok azonos elektronállapotúak,59-61,67 a CoC kötés enzimatikus homolízise nem tud hozzáférni egy gerjesztett elektronállapothoz, és egy másik folyamattal kell kezdeni a CoC kötés gyengítését és az egyensúly eltolását a disszociáció felé (lásd 5.11.2. szakasz). A feszültség által kiváltott hasadás nemcsak a CoC kötés homolízisét eredményezi, hanem ez a folyamat a gyökpár szétválasztási távolságát is növeli, ha a torzulás egy komponense az apikális kobalttengely mentén történik. A CoC kötés megnyújtásának ez a nyers erővel történő megközelítése lehet a leghatékonyabb módszer mind a homolízis, mind a gyökpár-rekombináció sebességének nettó csökkenése elérésére.

Az is lehetséges, hogy az enzim a CoC kötést erősíti és a homolízist kedvezőtlenül befolyásolja az apikális Co-α-N kölcsönhatás összenyomásával. Az adenozil-kobinamid + és + analógok termodinamikai tulajdonságait vizsgálták.68 A +-ban erősebb CoC kötést figyeltek meg, rövidebb CoN kötéstávolsággal a piridinhez mint α-axiális bázishoz képest. Az erősebb CoC kötés jelentős eltolódást eredményez a heterolízis mint preferált útvonal felé. Ebben a modellrendszerben a vizsgált enzimnek, a metilmalonyl-CoA mutáznak vagy meg kell akadályoznia a CoC heterolízist, vagy heterolitikus útvonalat kell követnie.68

A metionin-szintázban a kobalamin korrin része a 27 kDa-os fragmentum két doménje között helyezkedik el, a nukleotidfarok pedig a C-terminális domén maradékai által kialakított mély zsebbe hatol.7,69,70 Ez a szekvencia tartalmaz egy mérsékelten hidrofób régiót, amelyet meghosszabbított hidrofil szegmensek szegélyeznek.71 A korringyűrűvel interfészként érintkező domének között strukturális hasonlóságok várhatóak. A metionin-szintázban és a metilmalonyl-CoA-mutázban található α/β domén, amely a korringyűrű alsó feléhez kötődik és befogadja a meghosszabbított nukleotidfarkat (foszfodiészter-rész és 5,6-dimetilbenzimidazol-csoport), várhatóan a glutamátmutázban is megtalálható (vide infra).

A glutamátmutázban is várható (vide infra).