A kromatin hozzáférhetősége és felépítése

3. ábra: Kromoszóma-konformációs technikák. A 3C, 4C, 5C, ChIA-PET és Hi-C különböző lépései.

A kromatin konformáció rögzítése (3C)

A 3C formaldehid keresztkötést alkalmaz a háromdimenziós kromatinszerkezet rögzítéséhez, majd restrikciós enzimekkel történő emésztés következik. A kivágott DNS-töredékeket ezután qPCR és szekvenálás segítségével elemzik, hogy azonosítsák, hol kapcsolódnak a távoli DNS-régiók. Ezt a megközelítést a 3D kromatin szerkezetének és kölcsönhatásainak in vivo elemzésére először 2002-ben fejlesztették ki (Dekker et al., 2002), és azóta számos olyan kapcsolódó technika alapjává vált, amelyeket a nagyobb lépték, nagyobb áteresztőképesség vagy specifitás elérése érdekében fejlesztettek ki.

Circularized chromosome conformation capture (4C)

A 4C lehetővé teszi a korábban ismeretlen DNS-régiók azonosítását, amelyek kölcsönhatásba lépnek egy adott lokussal, ami a 4C-t ideálisvá teszi egy adott régión belüli új kölcsönhatások felfedezésére (Dekker et al., 2006).

4C hasznos tanácsok:

• Válassza ki a megfelelő restrikciós enzimeket. A gyakoribb vágók (azaz négy bp felismerőhely) jobbak az érdeklődésre számot tartó régió és az ugyanazon kromoszómán található közeli szekvenciák közötti helyi kölcsönhatásokhoz (van der Werken et al., 2012).
• Optimalizáljuk a keresztkötéseket. Az alacsonyabb formaldehidkoncentrációk elősegítik a nemkívánatos érdekrégiós önkötéseket, ugyanakkor megakadályozzák a restrikciós enzim vágását akadályozó DNS-“hajcsomókat”. A magas formaldehid-koncentrációk csökkentik az önligációs eseményeket, de növelik a hajlabdákat. Az optimális formaldehidkoncentrációt az adott kísérleti helyzethez kell megválasztani, hogy e szempontok egyensúlyban legyenek. Az 1%-os formaldehidkezelés 10 percig jó kiindulópont a legtöbb kísérlethez (van der Werken et al., 2012).

A kromoszóma-konformáció rögzítése (5C)

Az 5C könyvtárat hoz létre a céllocihoz társuló DNS-régiók bármely ligációs termékéből, amelyet aztán NGS-sel elemeznek. Az 5C ideális, ha nagy részletességre van szükség egy adott régió összes kölcsönhatásáról, például egy adott kromoszóma részletes kölcsönhatási mátrixának ábrázolásakor. Az 5C azonban nem igazán genom-szerte alkalmazható, mivel minden egyes 5C primert egyedileg kell megtervezni, így leginkább egy adott régióra alkalmas (Dotsie és Dekker, 2007).

5C hasznos tanácsok:

• A megfelelő restrikciós enzim kiválasztása. Alapvető fontosságú egy olyan enzim kiválasztása, amely hatékonyan működik az adott kísérleti körülmények között. A BamHI például nem ajánlott a legtöbb kísérlethez, mivel 3C körülmények között nem hatékony (Dotsie et al., 2007).
• Optimalizálja a primerek tervezését. Az 5C két primert használ: egy előre irányuló 5C primert, amely a ligációs hely előtt kötődik, és egy hátrafelé irányuló primert, amely közvetlenül a ligációs hely után kötődik. A primerek hosszát úgy kell beállítani, hogy a lágyulási hőmérséklet körülbelül 65 °C legyen, hogy a primerek pontosan lágyuljanak a restrikciós fragmentumokkal. Biztosítsa, hogy az 5C primereket úgy szintetizáljuk, hogy a ligáláshoz az 5′ végén foszfát legyen.
• Használjon kontrollsablont. Ez ellenőrizni fogja a primerek hatékonyságában mutatkozó különbségeket. Ajánlott a teljes vizsgált genomi régióból konstruált kontrollkönyvtárat használni. Ha ez a könyvtár nem készül, akkor a kutatóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a kölcsönhatási gyakoriságok kevésbé pontosak lesznek.

Chromatin kölcsönhatáselemzés párosított végű címkeszekvenálással (ChIA-PET)

A ChIA-PET a ChIP és a 3C szempontjait veszi alapul, hogy elemezze a távoli DNS-régiók kölcsönhatását egy adott fehérjén keresztül.

A ChIA-PET leginkább olyan felfedező kísérletekhez használható, amelyekben egy érdekes fehérje és ismeretlen DNS-kötő célpontok vesznek részt. A transzkripciós faktorok kötőhelyeit például a ChIA-PET-tel lehet a legjobban tanulmányozni, mivel ez a technika megköveteli, hogy a DNS-t a transzkripciós faktor in vivo kösse meg a kölcsönhatás megnevezéséhez (Fullwood és mtsai., 2009).

ChIA-PET hasznos tanácsok:

• A háttér csökkentése érdekében fedje át a PET-címkéket. A legtöbb 3C technológiához hasonlóan a háttérzaj technikai kihívást jelent. Különösen a ChIA-PET esetében a zaj megnehezítheti a hosszú távú kölcsönhatások megtalálását az érdeklődésre számot tartó lókuszokkal. Ennek leküzdésére hasznos tipp, ha a PET-ek átfedését követelik meg a régió mindkét végén, hogy hosszú távú kölcsönhatásról legyen szó.

ChIP-loop

A ChIP-loop a ChIP és a 3C keveréke, amely olyan antitesteket alkalmaz, amelyek olyan fehérjékre irányulnak, amelyekről feltételezhető, hogy kötődnek egy érdekes DNS-régióhoz. A ChIP-loop ideális annak megállapítására, hogy két ismert DNS-régió kölcsönhatásba lép-e egy érdekes fehérjén keresztül. A ChIP-loop alkalmas a feltételezett kölcsönhatások megerősítésére is, de új kölcsönhatások felfedezésére nem (Horike et al., 2005).

ChIP-loop hasznos tanácsok:

• Kerüljük a nem natív hurkokat. A ChIP-hurokkal kapcsolatban felmerülő legnagyobb probléma a DNS-koncentráció során kialakuló nem-natív hurkok kialakulása, mielőtt a ligálás megtörténne. Ennek elkerülésének egyszerű módja, ha olyan protokollt választunk, amely a ligációs lépés után végzi a kicsapást (Simons és mtsai., 2007).
• Validáljuk a ChIP-hurok kölcsönhatásokat. A ChIP-hurok másik kihívása a ligációs termékek pontos mennyiségi meghatározása lehet. A 3C technológiák, különösen a ChIP-loop, gyakran véletlenszerű kölcsönhatásokat rögzítenek. Ennek leküzdése érdekében fontolja meg egy ChIP-kísérlet párhuzamos elvégzését és annak felhasználását a ChIP-loop kölcsönhatások validálására. Ha a ChIP-loop által azonosított DNS-fehérje-DNS kölcsönhatás valóban valós, akkor mindkét DNS-fehérje kölcsönhatásnak meg kell jelennie a ChIP-adatokban is (Simons és mtsai., 2007).

Hi-C

Hi-C a teljes genomból amplifikálja a ligációs termékeket, és nagy áteresztőképességű szekvenálással értékeli azok gyakoriságát. A Hi-C kiváló választás, ha a teljes genom széles lefedettségére van szükség, és a felbontás nem jelent nagy gondot, például a kromoszómaszerkezet genomszintű változásainak feltérképezése tumorsejtekben (Lieberman-Aiden et al., 2009).

Hi-C hasznos tanácsok:

• A könyvtár amplifikációjának optimalizálása. A Hi-C könyvtár amplifikációjának elegendő terméket kell generálnia az elemzéshez, miközben el kell kerülni a PCR-artefaktumokat. Ehhez a PCR-ciklusszámot optimalizálni kell (9-15 ciklus közötti tartományban). Ha nem állítható elő elegendő termék (50 ng DNS), akkor a ciklusszám növelése helyett több PCR-reakciót kell összevonni, általában öt reakció elegendő (Belton et al., 2012).
• Olvasási hosszúságok kiegyensúlyozása. Mint minden szekvencia-kísérlet esetében, a kiváló minőségű leolvasások a legfontosabbak. A leolvasás hosszának optimálisnak kell lennie, hogy egyensúlyban legyen a hosszú leolvasások szükségessége a kölcsönhatások feltérképezéséhez, de ne legyen túl hosszú, hogy a ligációs csomóponton keresztül a partner fragmentumba kerüljön. Ezért a legtöbb esetben az 50 bp-os leolvasások optimálisak (Belton et al., 2012).
• Válassza ki a megfelelő bin méretét. Ez az adatelemzés szempontjából kritikus fontosságú. A bin méretnek fordítottan arányosnak kell lennie a régióban várható kölcsönhatások számával. A gyakoribb kromoszómán belüli kölcsönhatásokhoz használjunk kisebb binereket, a ritkább kromoszómák közötti kölcsönhatásokhoz pedig nagyobb binereket (Belton et al., 2012).

Capture-C

A 3C és az oligonukleotid befogási technológia (OCT) kombinációját használja nagy áteresztőképességű szekvenálással együtt több száz lokusz egyidejű vizsgálatához. A Capture-C ideális, ha egyszerre van szükség nagy felbontásra és genomikai léptékre. Például a genomban található minden betegséggel kapcsolatos SNP funkcionális hatásának elemzése a helyi kromatinszerkezetre (Hughes és mtsai., 2014).

Capture-C hasznos tanácsok:

• Gondosan válassza ki a szondapozíciókat. A legjobb, ha a szondákat a restrikciós enzimhelyek közelében helyezzük el, sőt, ha lehetséges, akár átfedésben is (Hughes et al., 2014).
• Tartsa a könyvtárakat komplexen. A könyvtár komplexitásának fenntartása a legfontosabb prioritás. A komplex könyvtár több jó minőségű kölcsönhatást jelent a kimenetben. Ezért kerülni kell mindent, ami csökkentheti a könyvtár komplexitását, például a Hi-C biotin befogását (Hughes és mtsai., 2014).
• Figyeljen a duplikált régiókban lévő hamis kölcsönhatásokra. A térképezési folyamat olyan erős kölcsönhatásokat stimulálhat ezek között a régiók között (például pszeudogének), amelyek valójában artefaktumok (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y és Dekker J (2012). Hi-C: átfogó technika a genomok konformációjának megragadására. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M és Kleckner N (2002). A kromoszómák konformációjának rögzítése. Science, 295, 1306-1311.

Dekker J. (2006). A kromoszóma-konformáció rögzítésének három “C”-je: ellenőrzések, ellenőrzések, ellenőrzések. Nat Methods, 3, 17-21.

Dostie J és Dekker J (2007). A genomi elemek közötti fizikai kölcsönhatások hálózatainak feltérképezése 5C technológiával. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y és Dekker J (2007). Kromoszóma-konformáció rögzítő szénmásolási technológia. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 21, Unit 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF és Kohwi-Shigematsu T (2005). A DLX5 csendes-kromatin hurokvesztése és imprinting károsodása Rett-szindrómában. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). Egy ösztrogénreceptor-alfa-kötésű humán kromatin interaktom. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). A nagy hatótávolságú kölcsönhatások átfogó feltérképezése feltárja a humán genom hajtogatási elveit. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (August 2014). Email interjú.

Hughes JR, et al. (2014). Több száz cisz-szabályozó tájkép nagy felbontású elemzése egyetlen, nagy áteresztőképességű kísérletben. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J és de Laat W (2007). A DNS kölcsönhatások megragadására szolgáló 3C-alapú módszerek értékelése. Nat Methods, 11, 895-901.

van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E és de Laat W (2012). 4C technológia: protokollok és adatelemzés. Methods Enzymol, 513, 89-112

.