A koleszterinszintézis szabályozása

00:00:08.12A nevem Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03és a Molekuláris Genetika Tanszékről jöttem
00:00:12.01a University of Texas Southwestern Medical Centerben, Dallasban, Texasban.
00:00:00:15.17Az előadásomban,
00:00:00:17.19a HMG CoA reduktáz visszacsatolásos szabályozásáról fogok beszélni,
00:00:00:20.27amely a koleszterin szintézisének sebességkorlátozó enzimje.
00:00:00:25.06Az alábbi dia a koleszterin szerkezetét
00:00:27.06és e fontos molekula néhány jellemzőjét mutatja be.
00:00:00:31.01A koleszterin egy szterin,
00:00:33.10amelyet ez a négygyűrűs szerkezet jellemez.
00:00:36.00Ez a négygyűrűs szerkezet merevséget kölcsönöz a molekulának,
00:00:39.02amely a sejtmembránok ideális összetevőjévé teszi.
00:00:00:43.18Most, mivel a koleszterin nagy számú szén-szén és szén-hidrogén kötéssel rendelkezik,
00:00:00:49.02ez a molekula gyakorlatilag vízben nem oldódik.
00:00:00:52.07Ezért,
00:00:54.13a sejteknek egy szűk tartományban kell tartaniuk a koleszterint,
00:00:58.03hogy elegendő koleszterin termelődjön a sejtek szükségleteinek kielégítésére
00:01:02.13de elkerüljék a koleszterin toxikus túlhalmozódását.
00:01:06.16A koleszterin túlhalmozódása sejtszinten toxikus lehet.
00:01:01:12.11Most, ez a dia a koleszterin néhány alapvető funkcióját mutatja be.
00:01:15.10A koleszterin elengedhetetlenül szükséges az élethez.
00:01:17.26Mint már említettem,
00:01:19.27a koleszterin egyik legismertebb szerepe
00:01:22.26a sejtmembránokban betöltött szerepe,
00:01:25.08ahol fenntartja a membránok optimális fluiditását.
00:01:29.
00:01:01:32.01A koleszterinről kiderül, hogy fontos prekurzora
00:01:32.01az olyan nagyon fontos molekuláknak, mint a szteroid hormonok,
00:01:34.25amelyek segítenek megkülönböztetni a lányokat a fiúktól;
00:01:38.19bilis savak, amelyek segítik az emésztést és a táplálkozást azáltal, hogy oldják az étkezési zsírokat és a zsírban oldódó vitaminokat;
00:01:01:47.10és végül a koleszterin bőséges az agyban,
00:01:01:50.18ahol az axonokat körülvevő myelinhüvelyekben található.
00:01:53.17és segít a szinap… szinaptikus átvitelben.
00:01:58.18A testünkben lévő sejtek – emlősök… emlősök sejtjei – két forrásból szerzik be a koleszterint.
00:02:02.01A koleszterint két forrásból szerzik be.
00:02:04.21Az egyik forrást ez a dia szemlélteti,
00:02:07.06és ez a koleszterin szintézise
00:02:09.19az acetil-CoA előanyagból.
00:02:13.00Az acetil-CoA koleszterinné való átalakulása
00:02:15.21több mint 20 enzim működésén keresztül történik.
00:02:20.22Most, ahogy el tudod képzelni,
00:02:22.21a koleszterin szintézise több köztes termék előállításával jár,
00:02:26.16és ezek a köztitermékek maguk is
00:02:29.14még nagyon fontos végtermékké alakulhatnak át.
00:02:33.11Ez a vegyület, a farnezil-pirrofoszfát például,
00:02:36.29a dolichol nevű fontos vegyület prekurzora,
00:02:40.25amely részt vesz az N-hez kötött glikozilációban.
00:02:43.26Ez is prekurzora a hemnek és az ubikinonoknak,
00:02:46.10amelyek részt vesznek a sejtlégzésben;
00:02:49.26vitamin K, amely részt vesz a véralvadásban;
00:02:02:53.12és végül, ez a farnezil pirofoszfát és geranilgeranil pirofoszfát
00:02:58.06 számos jelzőfehérjéhez kapcsolódik,
00:03:01.16kisebb GTP fehérjékhez,
00:03:03.22a membránokhoz irányítják őket,
00:03:06.12és ez a módosítás feltétlenül szükséges a sejt normális működéséhez.
00:03:13.04Most, ez a dia azt mutatja, hogy a koleszterin szintézise
00:03:16.02különböző szövetekben különböző sebességgel történik.
00:03:19.29Most, a máj és a mellékvesék
00:03:23.14szintetizálják a legtöbb koleszterint a szervezetünkben.
00:03:25.10És meg kell jegyeznem, hogy ezt valójában egereken végezték,
00:03:28.06de hasonló hatásokat látnak az embereknél
00:03:31.07és más főemlősöknél.
00:03:33.19A máj…. a máj nagy mennyiségű koleszterint szintetizál
00:03:36.24főként a lipoproteinek előállításához
00:03:39.14és az epesavszintézishez is.
00:03:42.10A mellékvesék koleszterint termelnek
00:03:45.28főleg a szteroid hormonok szintéziséhez,
00:03:48.13míg a bél koleszterint szintetizál…
00:03:51.27a sejtosztódáshoz.
00:03:54.12A bélben naponta nagyszámú sejt válik le
00:03:57.12és új sejtekkel kell pótolni,
00:03:59.27amelyhez jelentős mennyiségű koleszterinszintézisre van szükség.
00:04:03.28Meg kell jegyeznem azt is, hogy a bél a lipoprotein termelés forrása is.
00:04:09.21Azaz, most a koleszterin második forrása
00:04:12.12 tulajdonképpen a lipoproteinekből
00:04:15.16amelyeket a máj és a bél termel.
00:04:18.06Az itt látható alacsony sűrűségű lipoprotein modellje.
00:04:23.02Ez a fő koleszterinhordozó az emberi plazmában.
00:04:28.02Az alacsony sűrűségű lipoprotein, vagy LDL,
00:04:31.14Egy magból áll, amely szabad koleszterinből áll.
00:04:36.19A hidrofób koleszterin alkotja az LDL részecske magját.
00:04:41.19Ez a hidrofób koleszterin
00:04:44.01egy héj veszi körül, amely foszfolipidből áll
00:04:47.02 különböző mennyiségű észterezett koleszterinnel
00:04:51.13– ez olyan koleszterin, amelyhez egy zsírsav kapcsolódik —
00:04:55.14a foszfolipid héjba van beépülve.
00:04:59.03Az egész LDL részecskét egy apolipoprotein B nevű fehérje veszi körül.
00:05:08.02Ez a dia tulajdonképpen azt ábrázolja, hogy
00:05:10.17hogy a sejtek hogyan szerzik be a koleszterint ebből a két forrásból:
00:05:05:13.13az endogén szintézisből és az LDL-ből.
00:05:18.19Az LDL receptorok
00:05:21.09– a sejtek felszínén vannak–
00:05:23.20megkötődnek az LDL-hez, kölcsönhatásba lépve ezzel az apolipoprotein B részecskével
00:05:29.12amely körülveszi a lipoprotein héját.
00:05:32.25Mihelyt az LDL-részecske kötődik az LDL-receptorhoz,
00:05:35.27az egész komplex internalizálódik a bevont gödrökbe.
00:05:40.06Azután ezek a bevont gödrök a lizoszómákba kerülnek,
00:05:43.07ahol az LDL-részecske lebomlik és a koleszterin
00:05:47.15– szabad koleszterin —
00:05:49.25már felszabadul és a sejt rendelkezésére áll különböző felhasználási célokra.
00:05:54.18Ez tehát a sejtek koleszterinjének ez a két forrása
00:05:58.03– vagy a receptor…. LDL receptor által közvetített LDL endocitózisa,
00:06:03.07vagy az endogén szintézis révén —
00:06:06.02felcserélhetők.
00:06:09.01Így például, ha az LDL limitálttá válik,
00:06:12.00a sejt az endogén szintézisre vált koleszterinforrásként.
00:06:18.02És ha az endogén szintézis blokkolódik,
00:06:20.05akkor a sejtek már exogén LDL-t használhatnak
00:06:23.01 koleszterinforrásként.
00:06:27.00Aztán beszéltünk a koleszterin alapvető funkciójáról.
00:06:30.10Fontos a sejtmembránokban.
00:06:32.11A szteroid hormonok
00:06:34.28és az epesavak fontos előanyaga.
00:06:36.16A koleszterinnek azonban van egy rossz oldala is,
00:06:38.13és ezt szemlélteti ez a dia.
00:06:41.00A vér LDL-koleszterinjének emelkedett szintje
00:06:46.14a szívkoszorúér-betegség
00:06:49.19és a szívroham kockázatával jár.
00:06:51.16Az itt látható, hogy
00:06:54.27a vér koleszterinszintje
00:06:57.26szó szerint korrelál a koszorúér-betegség kockázatával.
00:07:01.09És ez azért van, mert az emelkedett koleszterin
00:07:04.21a koszorúérbe vezető artériákban lerakódhat…. a szívhez vezetnek.
00:07:08.12És idővel ez a lerakódás
00:07:11.15az ateroszklerózis nevű betegséghez vezet,
00:07:13.09amelyben a koleszterin lerakódása
00:07:15.04plakkok kialakulásához vezethet
00:07:17.12amelyek végül elzárhatják a véráramlást a szív felé,
00:07:19.18 ezáltal szívrohamot okozhatnak.
00:07:23.06Most, az egyik legszélesebb körben felírt gyógyszer
00:07:28.16az LDL-koleszterinszint csökkentése
00:07:31.11az úgynevezett sztatinok gyógyszercsoportja.
00:07:33.03Itt látható a sztatinok tipikus magszerkezete
00:07:37.26és néhány a sztatinok különböző formái
00:07:41.29amelyeket a klinikán már hasznosítottak.
00:07:44.22Az évek során a sztatinok
00:07:47.12a sztatinok az egyik legjelentősebb… a legnagyobb forgalmú gyógyszer…
00:07:49.10gyógyszerek az Egyesült Államokban
00:07:51.20mert képesek csökkenteni a vér LDL-koleszterinszintjét.
00:07:57.19Az ebben a kísérletben látható legalább négy tanulmány összefoglalása
00:08:02.23amelyek azt mutatják, hogy a sztatinok valóban csökkentik az LDL-koleszterinszintet
00:08:06.06és ez a csökkenés a szívkoszorúér-betegség előfordulásának
00:08:10.04csökkenéséhez vezet.
00:08:12.11Az itt látható zárt körökben tehát klinikai vizsgálatok
00:08:15.11melyekben a betegeket vagy sztatinnal kezelték, a… a zárt körökben látható,
00:08:20.22vagy placebóval.
00:08:22.11És minden ilyen vizsgálatban a sztatinkezelés az LDL-koleszterinszint csökkenéséhez vezetett,
00:08:28.06és ez az LDL-koleszterinszint-csökkenés
00:08:31.19a koszorúéresemények, azaz a szívroham csökkenéséhez vezetett.
00:08:35.13A kérdés tehát az, hogy hogyan hatnak a sztatinok?
00:08:38.21És mit csinálnak a sztatinok?
00:08:40.28Az első válaszunk az volt, hogy mit csinálnak a sztatinok?
00:08:43.16A sztatinok gátolják a HMG CoA reduktáz enzimet.
00:08:47.05 A HMG CoA reduktáz katalizálja a koleszterin szintézisének sebességkorlátozó lépését.
00:08:50.20.28Ez tulajdonképpen a negyedik lépés a koleszterin szintetikus útvonalán.
00:08:58.06A sztatinok tehát kompetitívan gátolják a HMG CoA reduktázt
00:09:01.20azzal, hogy a reduktáz reakció termékét, a mevalonátot utánozzák.
00:09:05.13Azzal, hogy a reduktáz reakció termékét, a mevalonátot utánozzák.
00:09:07.20A reduktáznak ez a kompetitív gátlása
00:09:10.19alapozza a sztatinok képességét a vérben lévőLDL-koleszterin csökkentésére.
00:09:18.07Hogyan hatnak a sztatinok?
00:09:20.17A HMG CoA reduktáz kompetitív gátlásával,
00:09:24.01ez a mevalonát mennyiségének csökkenéséhez vezet
00:09:27.09és persze a koleszterinszint csökkenéséhez.
00:09:30.18Ez a koleszterincsökkentés az LDL-receptort kódoló gén
00:09:33.12átírásának növekedéséhez vezet
00:09:36.06.
00:09:37.25És ennek következtében az LDL-receptorok száma a felszínen…
00:09:41.14különösen a májsejteken,
00:09:43.15és ez az LDL-receptorok számának növekedése
00:09:48.01a vér LDL-felvételének növekedéséhez vagy fokozódásához vezet.
00:09:52.25És ez a vér LDL csökkenés
00:09:55.26ez a felelős a koszorúér-betegség csökkenéséért
00:09:58.20a sztatin kezelt betegeknél.
00:10:02.12A sztatinok klinikai hatásait azonban
00:10:05.26a sztatinok valójában tompítják
00:10:09.06a HMG CoA reduktáz kompenzációs növekedése
00:10:11.10amely a sztatin terápiát kíséri.
00:10:13.19És ezt szemlélteti ez a dia.
00:10:15.13Ez a HMG CoA reduktáz fehérje immunoblotja
00:10:19.03azoknak az egereknek a májában, akiket sztatinnal etettek,
00:10:22.17vagy akár tenyésztett sejtekben
00:10:25.00amelyeket in vitro sztatinnal kezeltek.
00:10:26.24És ahogy láthatjuk,
00:10:28.20a sztatin kezelés jelentős felhalmozódást okoz
00:10:31.09a HMG CoA reduktáz.
00:10:33.10És ez a felhalmozódás, ahogy korábban említettem,
00:10:35.24elhalványítja a sztatinok klinikai hatásait.
00:10:38.12A következő kérdésünk tehát az, hogy miért okozzák a sztatinok a HMG CoA reduktáz ilyen magas szintű felhalmozódását.
00:10:41.27a HMG CoA reduktáz?
00:10:44.14Melyet a becslések szerint legalább 200-szorosra becsülik.
00:10:47.0200:10:49.29A HMG CoA reduktáz
00:10:51.25Ez tehát normális esetben hatalmas mennyiségű visszacsatolásos szabályozásnak van kitéve.
00:10:55.02 És ezt a visszacsatolásos szabályozást részben
00:10:57.29sterolok közvetítik.
00:11:00.02A sztatin kezelés, ahogy korábban említettem,
00:11:02.05blokkolja a HMG CoA reduktáz aktivitását,
00:11:04.12és megakadályozza ezeknek a szterol molekuláknak a szintézisét.
00:11:07.29És persze a szterolszintézis megakadályozása
00:11:10.26 tulajdonképpen az LDL-receptorok felszabályozásáért
00:11:14.17és az LDL-koleszterin későbbi csökkenéséért felelős.
00:11:18.09Mivel azonban a sztatinok
00:11:21.03blokkolják a szterolok szintézisét,
00:11:22.18megzavarják a reduktáz visszacsatolt szabályozását.
00:11:25.14És ennek következtében három esemény történik.
00:11:27.28Először, a koleszterin csökkenése miatt
00:11:31.09és a koleszterin szintetikus útvonal más termékeinek,
00:11:35.08a reduktáz gén fokozott átírása,
00:11:39.07a reduktáz mRNS fokozott transzlációja,
00:11:41.28a reduktáz mRNS transzlációja,
00:11:43.17és végül a reduktáz fehérje fokozott stabilitása
00:11:45.24a reduktáz fehérje.
00:11:47.13Ez a három esemény felelős
00:11:49.19azért a reduktáz fehérje jelentős növekedéséért
00:11:52.03Az előző dián mutattam.
00:11:55.18Az évek során tehát
00:11:57.06a laboratóriumomat az érdekelte, hogy megpróbáljuk megérteni
00:11:59.27azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek a
00:12:02.22fehérje fokozott stabilitásának hátterében állnak,
00:12:04.09és ez lesz az előadás hátralévő részében.
00:12:09.16Ez a dia tehát azt mutatja, hogy a szterolok
00:12:13.08gyorsítják a HMG CoA reduktáz lebomlását.
00:12:15.26Azt a kísérletet,
00:12:17.14Azt a kísérletet,
00:12:19.11klasszikus pulse-chase analízist használtunk
00:12:20.29a reduktáz stabilitásának nyomon követésére olyan sejtekben
00:12:23.16amelyeket szterinek hiányában vagy jelenlétében kezeltek.
00:12:26.00Azt csináljuk itt, hogy általában radioaktivitással jelöljük a sejteket,
00:12:29.27a HMG CoA reduktáz molekulák egy kis részhalmazát.
00:12:33.25Aztán kivesszük a radioaktivitást,
00:12:35.25és aztán követjük a reduktáz fehérje stabilitását
00:12:37.25sterolok hiányában vagy jelenlétében.
00:12:44.10És ahogy itt láthatjuk,
00:12:46.08mikor a sejteket radioaktivitást nem tartalmazó közegben kergetjük
00:12:49.07a reduktáz meglehetősen stabil az idő múlásával.
00:12:51.01sterolok hiányában
00:12:52.28a reduktáz meglehetősen stabil.
00:12:55.16However, as you can see,
00:12:57.21the addition of sterols in the chase medium
00:12:59.26causes the reductase levels to markedly decrease.
00:13:02.20Ez ismét a szterolok által felgyorsított lebomlást jelzi
00:13:06.04a HMG CoA reduktáz.
00:13:09.16Most, hogy megértsük a molekuláris mechanizmusokat
00:13:11.22a reduktáz szterol-indukált degradációjához,
00:13:14.15meg kell értenünk a HMG CoA reduktáz fehérje szerkezetét.
00:13:18.05És a reduktáz doménszerkezetét
00:13:20.14a dián látható.
00:13:22.18A HMG CoA reduktáz
00:13:24.16két különböző doménből áll.
00:13:26.28Ez egy N-terminális domén
00:13:29.06amely lehorgonyozza a fehérjét az endoplazmatikus retikulum,
00:13:32.14vagy az ER membránjában.
00:13:35.00Most, ez az N-terminális domén,
00:13:36.29amelyet membrán doménnek nevezünk,
00:13:39.04nyolc membránon átívelő régiót tartalmaz.
00:13:42.05És ezt követi a HMG CoA reduktáz második doménje,
00:13:45.07amelyet katalitikus doménnek nevezünk.
00:13:47.24A katalitikus domén tehát a sejtek citoszoljába nyúlik
00:13:51.24és tartalmazza a HMG CoA reduktáz teljes enzimaktivitását.
00:13:56.03A reduktáz csonka változata
00:13:59.29amely csak a katalitikus domént tartalmazza
00:14:02.13teljesen megmenti a mevalonát szintézisét
00:14:06.28azokban a sejtekben, amelyekből hiányzik a HMG CoA reduktáz.
00:14:10.13A katalitikus domén tehát szükséges és elégséges
00:14:13.01a mevalonát szintéziséhez.
00:14:15.29Azután felmerül a kérdés,
00:14:17.28mert miért membránhoz kötött ez a fehérje?
00:14:19.26És kiderül, hogy a reduktáz
00:14:22.02már az élesztőben is membránhoz kötött fehérje.
00:14:25.18A reduktáz membrán doménjének funkciója tehát
00:14:28.26a katalitikus domén és a teljes hosszúságú enzim stabilitását hasonlította össze.
00:14:35.08 – amely, ne feledjük, tartalmazza az enzimatikus aktivitást –
00:14:37.26és a teljes hosszúságú enzimét.
00:14:40.20És ismét egy egyszerű impulzus-keresési analízissel
00:14:42.21a két fehérje stabilitását figyelték meg.
00:14:47.13Amint a bal oldali panelen látható,
00:14:49.03a csonka katalitikus domén egy nagyon stabil fehérjét eredményez,
00:14:53.14amely… fontos,
00:14:57.08a lebomlását nem befolyásolják a szterolok.
00:14:59.20 Ezzel szemben a teljes hosszúságú fehérje – amely ismét tartalmazza a membrán domént –
00:15:03.07kevésbé stabil, még szterolok hiányában is.
00:15:06.13És látható, hogy a szterolok jelentősen felgyorsítják a HMG CoA reduktáz lebomlását,
00:15:12.09 ami arra utal, hogy a membrán domén…
00:15:15:15.12a membrán domén funkciója
00:15:17.25ez a szterol-gyorsított vagy szterol-indukált degradáció.
00:15:22.08Az, amit a korábbi vizsgálatok jeleztek
00:15:25.12az, hogy a reduktáz membrán doménje
00:15:28.03szükséges és elégséges a szterol-gyorsított lebontáshoz,
00:15:30.25és azt sugallták, hogy a membrán domén,
00:15:33.16 akár közvetlenül, akár közvetve,
00:15:35.16érzékeli a szterolok intracelluláris szintjét.
00:15:38.00és az érzékelés eredményezi, talán,
00:15:41.02a reduktáz membrán domén konformációs változása
00:15:43.29ami miatt a fehérje érzékeny lesz a gyors lebomlásra.
00:15:48.14 És természetesen, mivel a sztatinok blokkolják a koleszterinszintézist,
00:15:52.01a sztatinok valóban blokkolják ezt
00:15:54.22amit ER-asszociált degradációnak – vagy ERAD-nak – nevezünk
00:15:57.08a HMG CoA reduktáz.
00:16:02.23Az áttörés a HMG CoA reduktáz ERAD-jának megértésében
00:16:04.23a HMG CoA reduktáz ERAD-jának
00:16:06.15a fehérjepár felfedezésével történt
00:16:08.28– ER membrán fehérjék —
00:16:10.23az úgynevezett Insig-1 és Insig-2.
00:16:14.15Ezek az Insig fehérjék, az előadás szempontjából,
00:16:16.27nagyon redundánsak.
00:16:18.14Redundáns szerepet töltenek be a HMG CoA reduktáz lebontásában, vagy ERAD-ban,
00:16:22.06A HMG CoA reduktáz lebontásában.
00:16:24.00Ezek azonosak… kb. 85%-ban azonosak,
00:16:26.23és erősen hidrofób fehérjék.
00:16:29.24Az Insigs szerepét a HMG CoA reduktáz ERAD-jában
00:16:34.28 először ebben a kísérletben mutattuk be.
00:16:37.19Azaz, itt is impulzus üldözési analízist használtunk
00:16:40.15a reduktáz szterol-gyorsított degradációjának mérésére
00:16:43.29a reduktáz olyan sejtekben
00:16:47.02amelyeket vagy kontroll molekulákkal transzfektáltak,
00:16:51.06az úgynevezett siRNS-ek,
00:16:53.05vagy olyan sejtek, amelyeket siRNS-ekkel transzfektáltak,
00:16:55.26 amelyek mind az Insig-1, mind az Insig-2 expressziójának
00:16:58.13kieséséhez vezetnek.
00:17:02.07Amint a bal oldali panelen látható,
00:17:04.13a kontroll siRNS-ekkel transzfektált sejtekben,
00:17:08.04a szterolok jelentősen felgyorsítják a HMG CoA reduktáz degradációját
00:17:12.07a HMG CoA reduktáz.
00:17:14.13A nyitott körök tehát a sterolok hiányában végzett kísérletek,
00:17:17.09és a zárt körök a szterolok jelenlétében végzett
00:17:20.15kísérletek.
00:17:22.12És jól látható, hogy az Insig-1 és az Insig-2 kiütése
00:17:26.23teljesen megszünteti a szterolok által gyorsított degradációt,
00:17:30.02mivel azt jelzik, hogy ezek a fehérjék
00:17:32.28kulcsszerepet játszanak a folyamatban.
00:17:35.27A következő kérdésünk tehát az,
00:17:38.02melyik az a mechanizmus,
00:17:39.26mivel az Insigek felgyorsítják a HMG CoA reduktáz ERAD-ját?
00:17:47.09Ez a kísérlet…
00:17:48.21ez a dia azt mutatja, hogy a proteaszóma, a 26S proteaszóma gátlói
00:17:53.21blokkolják a HMG CoA reduktáz szterolok által indukált degradációját.
00:17:57.15Az első két sávban a szterolok a reduktáz jelentős degradációját okozták,
00:18:04.17és ez a degradáció teljesen blokkolódik
00:18:06.19mikor ezeket a sejteket proteaszóma inhibitorral kezeljük.
00:18:12.03Szóval… ez lehetővé teszi számunkra egy másik modell létrehozását
00:18:15.27melyben ismét a reduktáz membrán doménje
00:18:18:18.25vagy közvetlenül vagy közvetve
00:18:21.22érzékeli az intracelluláris szterolok szintjét,
00:18:24.15ez azt okozza, hogy a reduktáz Insig-hez kötődik,
00:18:28.12és ez az Insig-kötődés olyan reakciókhoz vezet, amelyek hatására a reduktáz
00:18:32.06már a 26S proteaszóma által lebomlik.
00:18:37.22Most már tudjuk, hogy a proteaszómák legtöbb szubsztrátja
00:18:41.00előzetes ubikvitinációt igényel.
00:18:44.05Az ubikvitináció egy olyan folyamat, amelynek során
00:18:46.23a kis fehérje ubikvitin kovalensen kötődik
00:18:50.16a szubsztrát molekulákhoz.
00:18:52.08Amikor pedig egy ubikvitin lánc
00:18:54.16a szubsztrátokhoz kapcsolódik,
00:18:56.08a proteaszómák felismerik és lebontják.
00:19:00.25 Ezt hívják poliubikvitinációnak,
00:19:02.25és a fehérjék poliubikvitinációja
00:19:05.14legalább három különböző típusú enzim működését igényli.
00:19:07.29Ezt szemlélteti ez a dia.
00:19:11.09Az első lépésben,
00:19:13.15azubikvitin aktiválódik
00:19:15.20 ATP-függő módon egy E1,
00:19:19.11 vagy ubikvitin aktiváló fehérje nevű enzim által.
00:19:22.15A következő lépésben az ubikvitin átkerül az E1-ről a…
00:19:27.13 egy másik enzimre, az E2-re, vagy ubikvitin-konjugáló enzimre.
00:19:32.16Az utolsó lépésben az E2 egyesül egy E3,
00:19:36.24 vagy ubikvitin ligázzal,
00:19:39.08amely viszont a szubsztráthoz kapcsolódik,
00:19:42.09az itt zölddel látható.
00:19:44.11Az E3 azt teszi, hogy megkönnyíti az ubikvitin átvitelét
00:19:47.27az ubikvitinkonjugáló enzimről
00:19:50.00a szubsztrátfehérje lizinmaradványára,
00:19:53.08generálva egy ubikvitinált szubsztrátot.
00:19:57.28Most, ez a folyamat sokszor történik,
00:20:00.02mígnem egy ubikvitin lánc épül fel a szubsztrátfehérjén.
00:20:06.02Azt már felismerik a proteaszómák, és lebontják.
00:20:10.18Azt figyelembe véve tehát, hogy ezek az Insig fehérjék
00:20:12.26szükséges a reduktáz lebontásához,
00:20:15.08és hogy a reduktáz valóban lebomlik a proteaszómák által,
00:20:19.02a következő kérdésünk az, hogy a reduktáz ubikvitinált-e?
00:20:23.20Ezt a kérdést megválaszoltuk ebben a kísérletben
00:20:26.11a dián látható.
00:20:28.21Azt csináltuk ebben a kísérletben, hogy kezeltük a sejteket
00:20:31.15sterolok nélkül és jelenlétében
00:20:33.20és a proteaszóma inhibitorral.
00:20:37.05Ezek a kezelések után,
00:20:39.11immunoprecipitáljuk a reduktázt
00:20:41.21és aztán ezeket az immunprecipitátumokat szondázzuk a teljes reduktázra,
00:20:43.20az alsó panelen látható,
00:20:45.18vagy az ubikvitinált reduktázra.
00:20:49.07Az első sávban látható,
00:20:51.01még ha a reduktáz le is húzódik ezekben a kísérletekben,
00:20:55.11nem látunk reaktivitást az ubikvitinációval.
00:20:58.14A sterolok hatására azonban a reduktáz ubikvitinálódik.
00:21:03.09És ez az ubikvitináció jelentősen fokozódik
00:21:07.22ha proteaszóma inhibitorokat is bevonunk.
00:21:09.27Ez tehát azt jelzi számunkra, hogy a szterolok
00:21:12.16a reduktáz ubikvitinálódik,
00:21:14.20és ezt az ubikvitinált fehérjét most a proteaszómák lebontják,
00:21:21:17.18mint azt az ubikvitinált reduktáz stabilitása jelzi
00:21:21.21ezek a proteaszóma inhibitorok.
00:21:24.27A következő kérdésünk az,
00:21:27.07Az Insigs szükséges a reduktáznak ehhez a szterol-indukált ubikvitinációjához?
00:21:32.16És ismét a siRNS-ekhez fordulunk.
00:21:35.08A sejteket vagy a kontroll siRNS-szel transzfektáltuk
00:21:38.18vagy az Insig-1 és -2 elleni siRNS-eket.
00:21:41.03Aztán ezeket a sejteket sterolok hiányában vagy jelenlétében kezeljük,
00:21:43.20és az ubikvitinált reduktáz szondát.
00:21:47.16És ahogy az első két sávban láthatjuk,
00:21:49.10a reduktáz szépen ubikvitinálódik szterolok jelenlétében,
00:21:52.08és az Insig-1 és Insig-2 kiütése
00:21:56.02teljesen megszünteti ezt az ubikvitinációt.
00:22:01.01Szóval, ez most lehetővé teszi számunkra, hogy több rést is betöltsünk a modellünkben
00:22:04.07a HMG CoA reduktáz Insig-mediált ERAD-jára vonatkozóan.
00:22:09.14Kiderült, hogy az Insig molekulák egy alcsoportja
00:22:12.00ténylegesen egy E3/E2 ubikvitin ligáz komplexhez társul.
00:22:16.27Mégis, szterolok jelenlétében,
00:22:20.15a reduktáz membrán doménje
00:22:23.03érzékeli a szterolokat,
00:22:24.25és ez az érzékelés a reduktáz Insig-hez kötődését okozza,
00:22:27.28és természetesen ezek az Insig-ek
00:22:31.13 majd áthidalják a reduktázt az E3/E2 ubikvitin ligáz komplexhez.
00:22:36.26Ez az áthidalás aztán a reduktáz ubikvitinációját eredményezi
00:22:40.00 a membrán domén két lizin maradékán.
00:22:43.17Az ubikvitináció hatására a reduktáz
00:22:46.17eltávolodik az ER-membránból
00:22:50.09és ezt követően a proteaszómák lebontják
00:22:52.22egy olyan folyamaton keresztül, amit nem értünk teljesen…
00:22:55.07egy olyan folyamaton keresztül, amit nem értünk teljesen.
00:23:00.20Szóval, összefoglalva, ma elmondtam, hogy
00:23:03.16hogy a HMG CoA reduktáz a koleszterin szintetikus útvonalának sebességkorlátozó enzime,
00:23:06.07és ez a koleszterinszint-csökkentő sztatinok célpontja.
00:23:08.01.26A reduktáz egy nagyon összetett
00:23:15.16feedback szabályozó rendszeren
00:23:18.01 keresztül szabályozódik, amelyet a koleszterin és más típusú szterinek közvetítenek.
00:23:20.18 És a sztatinok megzavarják ezt a visszacsatolt szabályozó rendszert,
00:23:24.03 részben azáltal, hogy blokkolják a HMG CoA reduktáz Insig-mediált ubikvitinációját
00:23:27.10és ERAD-ját.