Genetic of Myasthenia Gravis: A Case-Control Association Study in the Hellenic Population

Abstract

Myasthenia gravis (MG) é uma doença auto-imune heterogênea caracterizada pela produção de auto-anticorpos contra proteínas da membrana pós-sináptica, na junção neuromuscular. A contribuição de fatores genéticos para a suscetibilidade à MG tem sido avaliada através de estudos familiares e gêmeos, entretanto, o fundo genético preciso da doença permanece elusivo. Realizamos um estudo de associação caso-controle em 101 pacientes de origem helênica e 101 voluntários saudáveis, a fim de avaliar o envolvimento de variantes genéticas comuns na suscetibilidade à MG. Concentrámo-nos em três genes candidatos que têm sido claramente associados a várias doenças auto-imunes, com o objectivo de investigar a sua potencial implicação na patogénese da MG. Estes são o fator regulador de interferon 5 (IRF-5), a proteína 3 (TNFAIP3), também conhecida como A20, e a interleucina-10 (IL-10), moléculas chave na regulação da função imune. Foi revelada uma tendência estatística de associação () entre os polimorfismos de um único nucleotídeo promotor de IL-10 (SNPs) e os subgrupos de pacientes com MG precoce e tardia. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas no resto das variantes examinadas. Até onde sabemos, esta é a primeira tentativa mundial de abordar a possível associação entre IRF-5 e TNFAIP3 variantes genéticas comuns e a base genética da MG.

1. Introdução

Myasthenia gravis (MG) é uma doença auto-imune específica de órgãos causada por auto-anticorpos dirigidos contra as proteínas da membrana pós-sináptica, levando a uma transmissão neuromuscular prejudicada. Clinicamente, a MG é caracterizada por fraqueza muscular e fadiga rápida agravada pelo exercício e aliviada pelo repouso. O principal autoantigênio, em 80-90% dos pacientes com MG, é o receptor de acetilcolina muscular (AChR), um canal pentamericano que medeia a transdução sináptica na junção neuromuscular. Em vários dos restantes pacientes com MG, são detectados auto-anticorpos para a tirosina quinase específica do músculo (MuSK) ou para a proteína 4 relacionada à lipoproteína (LRP4). Tanto o MuSK quanto o LRP4 formam um complexo receptor que liga a matriz extracelular proteoglicana agrina, resultando no agrupamento da AChR, crítico para a função da junção neuromuscular.

A extensão da contribuição genética para a suscetibilidade à MG tem sido avaliada através de estudos familiares e gêmeos, refletindo o agrupamento familiar da doença e, posteriormente, da herança genética. Altas taxas de concordância de MG observadas entre gêmeos monozigóticos em comparação com gêmeos dizigóticos sugerem fortemente o envolvimento de fatores genéticos na patogênese da MG . Além disso, vários estudos relataram que pacientes com MG podem ser afetados por outra doença auto-imune, mais freqüentemente, distúrbios da tireóide e artrite reumatóide. Este achado leva à hipótese de que ocorre um distúrbio mais generalizado da função imunológica.

O complexo de antígeno leucocitário humano (HLA) é a região genômica proeminente implicada no aparecimento da MG. Os alelos HLA-A1 e B8 para classe I e DR3 para classe II constituem um haplótipo ancestral denominado “8.1” que tem sido reproduzivelmente associado com MG de início precoce e hiperplasia tímica. Pesquisas posteriores orientadas para a dissecção deste haplótipo A1-B8-DR3 estendido, levaram à identificação do locus MYAS1, uma região de 1,2 Mb abrangendo 36 genes, no limite da região da classe III e da região proximal da classe I, excluindo assim os loci da classe II e confirmando a associação predominante do alelo B8 sobre o do DR3 .

Parte do HLA, vários loci genéticos não ligados ao HLA também têm sido investigados quanto ao seu envolvimento na suscetibilidade à MG. Estes achados foram principalmente derivados de estudos de genes candidatos, enquanto os genes que foram relatados como associados ou não a MG são discutidos em detalhe em .

Interferon (IFN) fator regulador 5 (IRF-5) é um membro da família de fatores de transcrição IRF. O IRF-5 é ativado pelo IFN-α/B e upregula um conjunto de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-6, TNF-α e IL-12, enquanto induz ainda mais a expressão do gene IFN. Resultados de vários estudos, revisados em , implicaram o IRF-5 como um gene de suscetibilidade no LES. A pesquisa de variantes comuns que influenciam os níveis de IRF-5 levou à identificação do SNP rs10954213 (c.*555G > A), localizado dentro da seqüência de sinais de poliA+ AATAAA no 3′ UTR. O alelo G perturba o local da poliadenilação e a transcrição é terminada muito a jusante, produzindo assim transcrições IRF-5 mRNA mais longas e menos estáveis. Além disso, uma variante de 30-bp de inserção-deleção na estrutura (rs60344245) no sexto exon do IRF-5 determina a formação de duas famílias de isoformas de proteínas que têm capacidade diferencial para iniciar a transcrição dos genes alvo do IRF-5.

A proteína 3 induzida por TNFα (TNFAIP3), também conhecida como A20, é uma molécula chave na regulação de feedback negativo das respostas dependentes de NF-κB. O efeito inibitório da TNFAIP3 na sinalização da NF-κB é gerado a partir da atividade cooperativa de seus dois domínios de edição da ubiquitina: o domínio N-terminal do tumor ovariano (OTU), responsável pela interação da proteína 1 (RIP1) com o receptor deubiquitina, uma proteína adaptadora essencial da via de sinalização induzida pela TNF, e o domínio C-terminal do zinco contendo zinco, que funciona como uma ligase ubiquitina E3 promovendo a degradação proteasômica da RIP1 .

O SNP rs13207033 (g.137965418G > A), localizado na região intergênica 6q23, aproximadamente 185 kb a montante do TNFAIP3, provavelmente afeta a expressão gênica pela presença de potenciais elementos reguladores de DNA . Outro estudo indicou que um SNP de codificação não-sinônima (c.380T > G, rs2230926), resultando em uma alteração fenilalanina-cisteína no resíduo 127 (p.F127C), no domínio OTU da proteína TNFAIP3, está associado ao LES entre indivíduos de ascendência européia .

Interleucina-10 (IL-10) é uma citocina pleiotrópica secretada por diferentes tipos celulares, tais como células T e células da linhagem mielóide. A IL-10 tem sido caracterizada como uma citocina anti-inflamatória devido aos seus efeitos estimulantes sobre as células TH2 e à supressão simultânea das células TH1 . Além disso, a IL-10 induz a proliferação e diferenciação de linfócitos B ativados levando a uma maior ativação da resposta humoral. Em experiências autoimunes MG (EAMG), a administração de IL-10 causou o aumento dos níveis de anticorpos anti-AChR, sugerindo um papel de melhora da doença da IL-10 .

Several variants have been noticed in the 5′ flanking sequence of the human IL-10 gene. Três SNPs, a saber, rs45552637 (A/C), rs1800872 (T/C) e rs1800896 (A/G), localizados nas posições -592, -819 e -1082, respectivamente, determinam a formação de três haplótipos (GCC, ACC e ATA). A posição destes SNPs é baseada na seqüência U16720 previamente publicada, depositada na base de dados EMBL-EBI. Um estudo realizado por Turner e colegas de trabalho relatou a correlação desses haplótipos com a produção in vitro da proteína IL-10. Especificamente, o genótipo GCC/GCC foi associado à produção de alta concanavalina A induzida pela IL-10, genótipos GCC/ACC e GCC/ATA com média e genótipos ACC/ACC, ATA/ATA e ACC/ATA com baixa produção de IL-10.

No presente estudo, uma abordagem orientada por hipóteses foi adotada para avaliar o envolvimento de certas variantes comuns na suscetibilidade à MG. Assim, realizamos um estudo de caso-controle de genes candidatos, focando em genes com um papel crítico no funcionamento do sistema imunológico, visando identificar se associações previamente relatadas entre os genes acima e outras doenças auto-imunes poderiam se manter verdadeiras para a MG.

2. Materiais e Métodos

2.1. População do Estudo

Um total de 101 pacientes de MG não relacionados, todos de descendência helênica, foram matriculados neste estudo. Amostras de sangue de pacientes com MG foram coletadas no Hellenic Pasteur Institute durante a pesquisa diagnóstica de rotina. Apenas pacientes com RCA positivos para MG foram incluídos em nosso estudo. O diagnóstico de MG foi baseado na presença de anticorpos anti-AChR no soro do paciente, utilizando um ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA). Excluímos intencionalmente da análise genética os pacientes que foram identificados como positivos para auto-anticorpos contra MuSK, a fim de reduzir a heterogeneidade do grupo de estudo. Embora soros de pacientes com MG não tenham sido analisados para autoanticorpos anti-LRP4, a ausência deste teste não levanta problemas de heterogeneidade na população estudada, devido à rara coexistência de anticorpos anti-LRP4 e anti-AChR. As principais características do grupo anti-AChR MG (idade no início e sexo) estão resumidas na Tabela 1. O consentimento livre e esclarecido por escrito foi obtido pelos pacientes. O grupo controle consistiu de 101 indivíduos saudáveis etnicamente e sexualmente correlacionados.

2.2. Genotipagem

DNA genômico de cada indivíduo foi extraído de amostra de sangue venoso periférico usando o kit QIAamp Blood Midi (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). As reacções em cadeia da polimerase (PCRs) foram realizadas com o kit KAPA2G Fast HotStart ReadyMix (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, EUA). As sequências de primário são apresentadas nos materiais suplementares como Tabela Complementar 1 (ver Tabela 1 em Material Suplementar disponível online em http://dx.doi.org/10.1155/2012/484919), enquanto que as condições de reacção estão disponíveis a pedido.

Amplificação por PCR e análise electroforese em gel de agarose foram usadas para genotipificar a variante de inserção/delecção de 30 bp de IRF5.

Ensaio de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) baseado em PCR foi usado para a detecção de SNP rs2230926 (T > G) em TNFAIP3. Os fragmentos amplificados de 549 bp foram digeridos com a enzima de restrição Fnu4HI (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) e foram então analisados por separação eletroforética em gel de agarose a 2% p/v. O alelo G cria um local de restrição do Fnu4HI, resultando na digestão de amplicons a fragmentos de 319 e 230 bp.

A identificação dos genótipos SNPs promotores da IL-10 foi realizada por sequenciamento direto do DNA Sanger. Um fragmento de 585 bp, incluindo as três variantes, foi amplificado por PCR. Os produtos PCR foram purificados através do kit de purificação PureLink PCR em coluna (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A sequência do fragmento de 585 bp foi determinada usando o kit de química BigDye Terminator v3.0 num sequenciador de ADN Applied Biosystems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Os primers utilizados foram os mesmos que os utilizados para a amplificação desta região.

Both SNPs, rs10954213 (A/G) no 3′ UTR do IRF5 e rs13207033 (G/A) localizado em uma região intergênica 6q23, foram genotipados por PCR em tempo real e análise de curva de fusão de alta resolução (HRM) em um ciclador em tempo real RotorGene Q (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). A amplificação do fragmento contendo o SNP de interesse foi realizada utilizando o kit de PCR Type-it HRM (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Durante a HRM, a temperatura aumenta de 65 a 95°C, com uma taxa de aquecimento de 0,1°C/2 seg, levando à desnaturação dos produtos PCR e à geração de curvas de fusão, características de cada genótipo. Uma vez que uma única mudança de par de base causa uma mudança significativa na temperatura de fusão (), a genotipagem é baseada na análise dos perfis de fusão: homozigotos para o alelo A exibem perfis de fusão semelhantes e com um perfil de fusão mais baixo, comparado com os homozigotos G/G, enquanto os heterozigotos são diferenciados por uma mudança na forma da curva de fusão.

Nenhum controle de modelo foi meticulosamente incluído em todos os processos de genotipagem. Amostras de controle negativas e positivas foram inicialmente identificadas por sequenciamento de DNA e foram, posteriormente, utilizadas em todos os métodos de genotipagem. Cada amostra foi testada em duplicado, excepto as analisadas por PCR-RFLP e sequenciação de ADN.

2.3. Análise Estatística

As diferenças na distribuição genotípica e frequências alélicas entre casos e controles foram calculadas por análise ou teste Exato de Fisher. valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

3. Resultados

As distribuições genotípicas de todas as variantes foram consistentes com o equilíbrio de Hardy-Weinberg tanto no grupo de pacientes MG quanto no grupo controle (dados não mostrados).

As frequências dos alelos e genótipos da variante IRF-5 rs60344245 mostraram uma distribuição similar nos grupos de 101 pacientes com MG e 100 controles (). Em relação ao IRF-5 rs10954213 SNP, o genótipo A/G foi encontrado um pouco mais frequente em pacientes com MG do que em controles (54,8% versus 45,5%), mas a análise não revelou diferença significativa (). As frequências de alelo e genótipo de ambas as variantes do IRF-5 são mostradas na Tabela 2.

A frequência do genótipo TNFAIP3 rs13207033 G/G mostrou um aumento nos controles saudáveis (44,6%) em comparação com os pacientes com MG (33,3%). Entretanto, a análise estatística não indicou qualquer diferença significativa entre os dois grupos (). No caso dos rs2230926 codificação SNP, os genótipos são distribuídos de forma semelhante nos 73 pacientes com MG e 81 controles examinados, como é inferido pelo valor . As frequências genótipos da variante rs2230926, tanto nos pacientes com MG como nos controles, estão de acordo com aquelas derivadas de amostras de ascendência européia (ECU) que fazem parte do projeto internacional HapMap. Além disso, o nosso grupo de estudo exibiu na base de dados dbSNP frequências genotípicas rs13207033 que são comparáveis às frequências reportadas nas populações europeias. Os resultados da genotipagem das duas variantes do TNFAIP3 estão resumidos na Tabela 3.

A idade de início da doença também foi avaliada pela divisão de pacientes de MG em pacientes de início precoce e pacientes de início tardio. Nenhuma diferença significativa na distribuição genotípica foi detectada entre os dois subgrupos e o grupo controle (dados não mostrados).

A análise da seqüência DNA da região promotora da IL-10 mostrou que o genótipo ACC/GCC foi o genótipo mais freqüentemente observado tanto em pacientes com MG quanto em controles (23,72% e 28%, resp.), seguido pelo genótipo de baixa secreção ATA/ACC, que foi detectado em 21,62% do total de MG e 18% dos controles (Tabela 4). Entretanto, o presente estudo não revelou qualquer diferença estatisticamente significativa na distribuição do genótipo IL-10 entre a coorte completa de pacientes com MG (ou seja, MG total) e o grupo controle (). A comparação entre os subconjuntos de acordo com a idade de início demonstrou que o genótipo de alta secreção de IL-10 GCC/GCC é encontrado em baixa freqüência nos casos de MG de início precoce (4%), enquanto está super-representado nos casos de MG de início tardio (20%) (Tabela 4). Foi revelada uma tendência estatística de associação () entre a distribuição do fenótipo IL-10 e os dois subgrupos de início precoce e de início tardio (Figura 1).

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4. Discussão

MG é uma doença auto-imune heterogénea com uma clara predisposição genética. Para além dos loci HLA, várias variantes comuns nos genes não ligados ao HLA foram associadas à susceptibilidade à MG . Muitos destes genes associados ao risco estão amplamente distribuídos entre várias doenças auto-imunes, suportando a noção de que as doenças auto-imunes são caracterizadas por vias patogénicas partilhadas. Neste estudo, realizamos um estudo de associação caso-controle para investigar a contribuição de variantes comuns localizadas nos genes IRF-5, TNFAIP3 e IL-10 para a suscetibilidade à MG. Estes genes foram considerados bons candidatos devido ao seu papel crítico na regulação da resposta imune e sua implicação previamente conhecida no processo auto-imune. Apenas pacientes com anticorpos anti-AChR em seu soro foram incluídos na análise genética, já que se esperava que eles representassem um subconjunto mais homogêneo do que o grupo mais amplo de MG. Este subgrupo foi ainda dividido em duas entidades distintas de doença: pacientes com MG precoce, compreendendo principalmente mulheres, e pacientes com MG tardia, mostrando uma proporção maior de homens.

Até onde sabemos, este é o primeiro estudo, em qualquer população, para investigar a associação entre MG e variantes comuns dos genes IRF-5 e TNFAIP3. De acordo com estudos anteriores, revisados em , várias variantes no locus IRF-5 foram reprodutivamente associadas ao LES implicando o IRF-5 como um gene de suscetibilidade em lúpus. O SNP rs10954213 tem influenciado a poliadenilação do mRNA, prejudicando assim os níveis da proteína IRF-5; homozigotos A/A expressam aproximadamente 5 vezes mais níveis de IRF-5 imunoreativos em comparação com os homozigotos G/G. Quanto à variante rs60344245, a eliminação de 30 bp (GGCCGCCTACTCTGCAGCCGCCCACTCTGC/-) remove 10 aminoácidos da proteína IRF-5 e altera um domínio rico em prolina, ácido glutâmico, serina e três átomos (PEST). Na família de proteínas IRF, esses domínios participam de interações protéicas e também causam rápida degradação proteolítica . Apesar de seu óbvio papel funcional, o estudo atual não demonstrou uma associação significativa das variantes IRF-5 rs10954213 e rs60344245 com MG ( e , resp.), sugerindo que IRF-5 pode não estar envolvido na patogênese de MG.

Outras conclusões recentes de estudos de GWA revelaram associações significativas entre variantes do locus humano TNFAIP3 e um amplo espectro de doenças auto-imunes. Um exame de GWA em pacientes com artrite reumatóide, com anticorpos peptídeos anticitrullinated, detectou forte evidência de associação do rs13207033 SNP com o desenvolvimento da AR . Da mesma forma, um estudo de Musone e colegas de trabalho relatou a associação da codificação não-sinônima SNP, rs2230926 com o LES . Estudos funcionais para determinar o impacto biológico do rs2230926 demonstraram que a proteína Cys127 menor apresenta uma diminuição da atividade inibitória . No entanto, foi observada falta de associação entre MG e TNFAIP3 rs13207033 () e rs2230926 () SNPs.

Todos juntos, nossos dados podem indicar que a MG específica do órgão pode ter um fundo genético diferente, levando à sua separação de um amplo grupo de doenças auto-imunes sistêmicas compreendendo o LES e a AR . Uma explicação alternativa para a falta de associação em nosso estudo poderia estar relacionada ao poder estatístico insuficiente devido ao tamanho relativamente pequeno das amostras. Como é geralmente conhecido, as variantes comuns são responsáveis por uma proporção modesta do risco genético relativo às doenças auto-imunes. Nesses casos, milhares de amostras podem ser necessárias para detectar um sinal de associação que possa ser distinguido do ruído de fundo . No entanto, em doenças de baixa prevalência, como a MG, o recrutamento de amostras de grande tamanho é muito difícil. Vale mencionar que a unidade de diagnóstico de MG no Instituto Hellenic Pasteur é a única unidade na Grécia que tem recebido e analisado sistematicamente amostras de sangue desde 1983. Portanto, nossa coleta de amostras de DNA de MG é atualmente a maior da Grécia e é constantemente enriquecida por novos casos.

Mais ainda, apesar da seleção específica de pacientes anti-AChR e sua divisão em precoce e tardia, uma classificação adicional de acordo com as anomalias do timo (timoma ou hiperplasia) poderia ter sido informativa; entretanto, os dados histológicos não estavam disponíveis.

Finalmente, um resultado inesperado foi a falta de associação dos SNPs promotores da IL-10 com a MG. Como se presume que essas variantes estejam dentro da região promotora da IL-10, elas podem afetar a vinculação dos fatores de transcrição que regulam a expressão da IL-10. Um estudo recente de Alseth e colegas de trabalho, conduzido na população norueguesa, revelou uma associação do genótipo ACC/ACC com o subgrupo de pacientes com anticorpos de titina para MG positivos, enquanto um aumento estatisticamente significativo da frequência ATA/ATA foi observado em pacientes com MG precoces. Em nosso grupo de casos de MG helênica, não foi detectada nenhuma evidência de associação, quando comparamos a distribuição genotípica entre a coorte completa de pacientes com MG e o grupo controle (). Entretanto, o genótipo GCC/GCC revelou uma tendência estatística de associação com a MG, nos distintos subgrupos de pacientes com MG precoce e tardia (). Assim, estudos adicionais em amostras maiores poderiam revelar possíveis associações de MG com IL-10. Também é digno de nota o fato de que as frequências alélicas para um determinado SNP podem variar substancialmente entre grupos étnicos. A diferença observada na frequência do genótipo ACC/ACC entre os grupos controle norueguês e helênico (3,4% versus 15%) é refletiva desta condição.

Overtodo, este tem sido o primeiro esforço, para nosso conhecimento, para abordar a possível associação entre variantes genéticas comuns de IRF-5 e TNFAIP3 e a base genética da MG, em qualquer população, enquanto que estudos adicionais são necessários para desvendar o, ainda que largamente desconhecido, histórico genético da MG.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos pacientes e voluntários que participaram do nosso estudo. Anna Kokla e Maria Belimezi do Instituto Hellenic Pasteur são agradecidas pela assistência na coleta de amostras de pacientes com MG. O presente estudo foi apoiado financeiramente pela Comissão Europeia, através de subsídios Fight MG a S. J. Tzartos e GEN2PHEN (FP7-200754) a G. P. Patrinos, com a participação de fundos do projecto Thales (Autoimunidade) a S. J. Tzartos e K. Poulas e do projecto Hellas/Turkey Bilateral Collaboration (MuSK-myasthenia gravis) a K. Poulas.

Materiais Suplementares