Régulation de la synthèse du cholestérol

00:00:08.12Mon nom est Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03et je suis du département de génétique moléculaire
00:00:12.01à l’Université du Texas Southwestern Medical Center à Dallas, Texas.
00:00:15.17Dans cette présentation,
00:00:17.19je parlerai de la régulation par rétroaction de la HMG CoA réductase,
00:00:20.27qui est l’enzyme limitant la vitesse de synthèse du cholestérol.
00:00:25.06Alors, cette diapositive montre la structure du cholestérol
00:00:27.06et certaines des caractéristiques de cette importante molécule.
00:00:31.01Le cholestérol est un stérol,
00:00:33.10qui se distingue par cette structure à quatre anneaux.
00:00:36.00Cette structure à quatre anneaux confère de la rigidité à cette molécule,
00:00:39.02ce qui en fait un composant idéal des membranes cellulaires.
00:00:43.18Maintenant, parce que le cholestérol a un grand nombre
00:00:46.07de liaisons carbone-carbone et carbone-hydrogène,
00:00:49.02cette molécule est pratiquement insoluble dans l’eau.
00:00:52.07Donc, pour cette raison,
00:00:54.13les cellules doivent être capables de maintenir le cholestérol dans une fourchette étroite,
00:00:58.03de sorte que suffisamment de cholestérol soit produit pour les besoins cellulaires de la molécule
00:01:02.13mais évite la suraccumulation toxique de cholestérol.
00:01:06.16La suraccumulation de cholestérol peut être toxique au niveau cellulaire.
00:01:12.11Maintenant, cette diapositive montre certaines des fonctions essentielles du cholestérol.
00:01:15.10Le cholestérol est absolument nécessaire à la vie.
00:01:17.26Comme je l’ai mentionné précédemment,
00:01:19.27l’un des rôles les plus reconnus du cholestérol
00:01:22.26est son rôle dans les membranes cellulaires,
00:01:25.08où il maintient une fluidité optimale de la membrane.
00:01:29.00Maintenant, le cholestérol s’avère être un précurseur important
00:01:32.01pour des molécules très importantes telles que les hormones stéroïdes,
00:01:34.25qui aident à distinguer les filles des garçons;
00:01:38.19les acides biliaires, qui aident à la digestion et à la nutrition en solubilisant les graisses alimentaires et les vitamines liposolubles;
00:01:47.10et puis enfin, le cholestérol est abondant dans le cerveau,
00:01:50.18où on le trouve dans les gaines de myéline qui entourent les axones
00:01:53.17et aident aux transmissions synap… synaptiques.
00:01:58.18Maintenant, les cellules de notre corps — mammifères… cellules mammifères —
00:02:02.01acquièrent le cholestérol par deux sources.
00:02:04.21L’une de ces sources est illustrée dans cette diapositive,
00:02:07.06et c’est par la synthèse du cholestérol
00:02:09.19à partir du précurseur acétyl CoA.
00:02:13.00Maintenant, la conversion de l’acétyl CoA en cholestérol
00:02:15.21se produit par l’action de plus de 20 enzymes.
00:02:20.22Maintenant, comme vous pouvez l’imaginer,
00:02:22.21la synthèse du cholestérol implique la production de plusieurs intermédiaires,
00:02:26.16et ces intermédiaires eux-mêmes
00:02:29.14peuvent aussi être convertis en produits finaux très importants.
00:02:33.11Par exemple, ce composé, le pyrophosphate de farnésyle,
00:02:36.29est un précurseur pour un composé important appelé dolichol,
00:02:40.25qui est impliqué dans la glycosylation N-liée.
00:02:43.26C’est aussi un précurseur pour l’hème et les ubiquinones,
00:02:46.10qui sont impliqués dans la respiration cellulaire;
00:02:49.26vitamine K, qui intervient dans la coagulation du sang;
00:02:53.12et enfin, ce pyrophosphate de farnésyle et ce pyrophosphate de géranylgéranyle
00:02:58.06sont attachés à de nombreuses protéines de signalisation,
00:03:01.16de petites protéines GTP,
00:03:03.22les dirigeant vers les membranes,
00:03:06.12et cette modification est absolument nécessaire au fonctionnement normal de la cellule.
00:03:13.04Maintenant, cette diapositive montre que la synthèse du cholestérol
00:03:16.02se produit dans divers tissus à des rythmes différents.
00:03:19.29Maintenant, le foie et les glandes surrénales
00:03:23.14synthétisent le plus de cholestérol dans notre corps.
00:03:25.10Et je dois préciser que cela a en fait été fait sur des souris,
00:03:28.06mais des effets similaires sont observés chez les humains
00:03:31.07et d’autres primates.
00:03:33.19Le foie… le foie synthétise de grandes quantités de cholestérol
00:03:36.24pour principalement la production de lipoprotéines
00:03:39.14et aussi pour la synthèse des acides biliaires.
00:03:42.10Les glandes surrénales produisent du cholestérol
00:03:45.28principalement pour la synthèse des hormones stéroïdes,
00:03:48.13alors que l’intestin synthétise le cholestérol pour…
00:03:51.27pour la division cellulaire.
00:03:54.12Un grand nombre de cellules de l’intestin sont éliminées chaque jour
00:03:57.12et doivent être remplacées par de nouvelles cellules,
00:03:59.27ce qui nécessite une quantité marquée de synthèse de cholestérol.
00:04:03.28Je dois également souligner que l’intestin est également une source de production de lipoprotéines.
00:04:09.21Alors, maintenant, la deuxième source de cholestérol
00:04:12.12est en fait les lipoprotéines
00:04:15.16qui sont produites par le foie et l’intestin.
00:04:18.06Donc, on voit ici un modèle de la lipoprotéine de basse densité.
00:04:23.02C’est le principal transporteur de cholestérol dans le plasma humain.
00:04:28.02Donc, la lipoprotéine de basse densité, ou LDL,
00:04:31.14constitue un noyau qui est composé de cholestérol libre.
00:04:36.19Donc, le cholestérol hydrophobe forme le noyau de la particule LDL.
00:04:41.19Maintenant, ce cholestérol hydrophobe
00:04:44.01est entouré d’une enveloppe composée d’un phospholipide
00:04:47.02 avec diverses quantités de cholestérol estérifié
00:04:51.13 – c’est du cholestérol auquel un acide gras a été attaché –
00:04:55.Maintenant, toute cette particule de LDL
00:05:02.18 est entourée par une protéine appelée apolipoprotéine B.
00:05:08.02 Ainsi, cette diapositive décrit en fait
00:05:10.17comment les cellules acquièrent le cholestérol à partir de ces deux sources :
00:05:13.13synthèse endogène et à partir des LDL.
00:05:18.19Donc, les récepteurs LDL
00:05:21.09- ils sont à la surface des cellules —
00:05:23.20se lient aux LDL en interagissant avec cette particule d’apolipoprotéine B
00:05:29.12 qui entoure l’enveloppe de la lipoprotéine.
00:05:32.25Une fois que la particule de LDL se lie au récepteur de LDL,
00:05:35.27le complexe entier est internalisé dans des puits enrobés.
00:05:40.06Et ces puits enrobés sont ensuite dirigés vers les lysosomes,
00:05:43.07où la particule de LDL est dégradée et le cholestérol
00:05:47.15– le cholestérol libre —
00:05:49.25 est maintenant libéré et fourni à la cellule pour diverses utilisations.
00:05:54.18Donc, encore une fois, ces deux sources de cholestérol cellulaire
00:05:58.03– soit du récepteur…. endocytose des LDL médiée par le récepteur LDL,
00:06:03.07soit par la synthèse endogène —
00:06:06.02peuvent être utilisées de manière interchangeable.
00:06:09.01Donc, par exemple, si le LDL devient limitant,
00:06:12.00la cellule passe à la synthèse endogène pour ses sources de cholestérol.
00:06:18.02Et si la synthèse endogène est bloquée,
00:06:20.05alors les cellules peuvent maintenant utiliser le LDL exogène
00:06:23.01pour leur source de cholestérol.
00:06:27.00Donc, nous avons parlé de la fonction essentielle du cholestérol.
00:06:30.10Il est important dans les membranes cellulaires.
00:06:32.11Il est un précurseur important des hormones stéroïdes
00:06:34.28et des acides biliaires.
00:06:36.16Pour autant, il y a un mauvais côté du cholestérol,
00:06:38.13et c’est illustré dans cette diapositive.
00:06:41.00Depuis un certain nombre d’années, des niveaux élevés de cholestérol LDL sanguin
00:06:46.14sont associés à un risque de maladie coronarienne
00:06:49.19et de crise cardiaque.
00:06:51.16Donc, illustré ici, vous pouvez voir que
00:06:54.27le niveau de cholestérol sanguin
00:06:57.26est littéralement corrélé avec le risque de maladie coronarienne.
00:07:01.09Et ceci parce qu’un taux élevé de cholestérol
00:07:04.21peut en fait se déposer dans les artères qui mènent au… au cœur.
00:07:08.12Et avec le temps, ce dépôt
00:07:11.15résulte en une maladie appelée athérosclérose,
00:07:13.09dans laquelle ce dépôt de cholestérol
00:07:15.04peut conduire à la production de plaques
00:07:17.12qui peuvent finalement bloquer le flux sanguin vers le cœur,
00:07:19.18créant ainsi une crise cardiaque.
00:07:23.06Maintenant, l’un des médicaments les plus largement prescrits
00:07:28.16pour réduire le cholestérol LDL
00:07:31.11est un groupe de médicaments appelés statines.
00:07:33.03Voici la structure de base typique des statines
00:07:37.26et certaines des différentes formes de statines
00:07:41.29qui ont été utilisées en clinique.
00:07:44.22Au fil des ans, les statines
00:07:47.12sont devenues l’un des médicaments les plus… les plus vendus…
00:07:49.10médicaments aux États-Unis
00:07:51.20en raison de leur capacité à réduire le cholestérol LDL sanguin.
00:07:57.19Donc, ce qui est montré dans cette expérience est un résumé d’au moins quatre études
00:08:02.23qui révèlent que les statines réduisent effectivement le cholestérol LDL
00:08:06.06 et que cette réduction entraîne une diminution de l’incidence
00:08:10.04des maladies coronariennes.
00:08:12.11Donc, montrés ici dans les cercles fermés sont des essais cliniques
00:08:15.11dans lesquels les patients ont été traités soit avec une statine, indiquée dans les… indiquée dans les cercles fermés,
00:08:20.22ou un placebo.
00:08:22.11Et dans chacune de ces études, le traitement par statine a conduit à
00:08:25.17une baisse du taux de cholestérol LDL,
00:08:28.06et cette baisse du taux de cholestérol LDL
00:08:31.19a conduit à une réduction des événements coronariens, c’est-à-dire des crises cardiaques.
00:08:35.13Alors, la question devient, vous savez, comment fonctionnent les statines ?
00:08:38.21Et que font les statines ?
00:08:40.28Donc, nous avons d’abord répondu, que font les statines ?
00:08:43.16Donc, les statines inhibent l’enzyme HMG CoA réductase.
00:08:47.05La HMG CoA réductase catalyse
00:08:50.20l’étape limitant le taux de synthèse du cholestérol.
00:08:53.28C’est en fait la quatrième étape de la voie de synthèse du cholestérol.
00:08:58.06Donc, les statines inhibent de manière compétitive l’HMG CoA réductase
00:09:01.20en imitant le produit de la réaction de la réductase,
00:09:05.13mévalonate.
00:09:07.20Donc, cette inhibition compétitive de la réductase
00:09:10.19sous-tend la capacité des statines à réguler à la baisse
00:09:14.18le cholestérolLDL dans le sang.
00:09:18.07Donc, comment agissent les statines ?
00:09:20.17Donc, encore une fois, en inhibant de manière compétitive la HMG CoA réductase,
00:09:24.01cela entraîne une baisse des quantités de mévalonate
00:09:27.09et bien sûr une baisse du cholestérol.
00:09:30.18Cette déplétion en cholestérol entraîne une augmentation
00:09:33.12de la transcription du gène
00:09:36.06codant le récepteur des LDL.
00:09:37.25Et en conséquence, le nombre de récepteurs des LDL à la surface…
00:09:41.14surtout des cellules du foie,
00:09:43.15et cette augmentation des récepteurs des LDL conduit
00:09:48.01à une augmentation ou une amélioration de l’absorption des LDL sanguins.
00:09:52.25Et cette réduction du LDL sanguin
00:09:55.26est responsable de la diminution des maladies coronariennes
00:09:58.20chez les patients traités par statines.
00:10:02.12Cependant, les effets cliniques des statines
00:10:05.26sont en fait atténués par
00:10:09.06l’augmentation compensatoire de la HMG CoA réductase
00:10:11.10qui accompagne le traitement par statine.
00:10:13.19Et cela est illustré dans cette diapositive.
00:10:15.13C’est un immunoblot de la protéine HMG CoA réductase
00:10:19.03dans le foie de souris qui ont été nourries avec une statine,
00:10:22.17ou même dans des cellules en culture
00:10:25.00qui ont été traitées avec des statines in vitro.
00:10:26.24Et comme vous pouvez le voir,
00:10:28.20le traitement à la statine provoque une accumulation marquée
00:10:31.09de l’HMG CoA réductase.
00:10:33.10Et cette accumulation, comme je l’ai mentionné précédemment,
00:10:35.24émousse les effets cliniques des statines.
00:10:38.12Donc, notre prochaine question est, pourquoi les statines provoquent-elles
00:10:41.27l’accumulation de l’HMG CoA réductase à un niveau aussi élevé ?
00:10:44.14Qui, je dois le souligner, a été estimé à
00:10:47.02au moins 200 fois.
00:10:49.29Donc, normalement, l’HMG CoA réductase
00:10:51.25est soumise à une énorme quantité de régulation par rétroaction.
00:10:55.02Et cette régulation en retour est médiée en partie
00:10:57.29par les stérols.
00:11:00.02Maintenant, le traitement par statine, comme je l’ai mentionné plus tôt,
00:11:02.05bloque l’activité de l’HMG CoA réductase,
00:11:04.12et empêche la synthèse de ces molécules de stérol.
00:11:07.29Et bien sûr, cette prévention de la synthèse des stérols
00:11:10.26est en fait responsable de la régulation à la hausse des récepteurs LDL
00:11:14.17et de la réduction subséquente du cholestérol LDL.
00:11:18.09Cependant, comme les statines
00:11:21.03bloquent la synthèse des stérols,
00:11:22.18elles perturbent la régulation par rétroaction de la réductase.
00:11:25.14Et en conséquence, trois événements se produisent.
00:11:27.28Premièrement, en raison de cette réduction du cholestérol
00:11:31.09et des autres produits de la voie de synthèse du cholestérol,
00:11:35.08il y a une transcription accrue du gène de la réductase,
00:11:39.07il y a une traduction accrue
00:11:41.28de l’ARNm de la réductase,
00:11:43.17et enfin il y a une stabilité accrue
00:11:45.24de la protéine réductase.
00:11:47.13Donc, ces trois événements sont responsables
00:11:49.19de cette augmentation marquée de la protéine réductase
00:11:52.03que je vous ai montrée dans la diapositive précédente.
00:11:55.18Alors, au fil des années,
00:11:57.06 mon laboratoire s’est intéressé à essayer de comprendre
00:11:59.27les mécanismes moléculaires qui sous-tendent
00:12:02.22cette stabilité accrue de la protéine,
00:12:04.09et ce sera le sujet du reste de cette présentation.
00:12:09.16Donc, cette diapositive illustre que les stérols
00:12:13.08accélèrent en effet la dégradation
00:12:15.26de la HMG CoA réductase.
00:12:17.14Donc, dans cette expérience,
00:12:19.11nous avons utilisé l’analyse classique du pulse-chase
00:12:20.29pour surveiller la stabilité de la réductase dans les cellules
00:12:23.16qui ont été traitées en absence ou en présence de stérols.
00:12:26.00Donc, ce que nous faisons ici, c’est que nous marquons généralement les cellules avec de la radioactivité,
00:12:29.27un petit sous-ensemble de molécules de HMG CoA réductase.
00:12:33.25Nous retirons ensuite cette radioactivité,
00:12:35.25puis nous suivons la pres…
00:12:37.25la stabilité de la protéine réductase
00:12:39.26en l’absence ou en présence de stérols.
00:12:44.10Et comme vous pouvez le voir ici,
00:12:46.08quand les cellules sont chassées dans des milieux
00:12:49.07qui ne contiennent pas de radioactivité,
00:12:51.01en l’absence de stérols
00:12:52.28la réductase est assez stable dans le temps.
00:12:55.16Cependant, comme vous pouvez le voir,
00:12:57.21l’ajout de stérols dans le milieu de chasse
00:12:59.26fait nettement diminuer les niveaux de réductase.
00:13:02.20A nouveau, cela indique la dégradation accélérée par les stérols
00:13:06.04de l’HMG CoA réductase.
00:13:09.16Maintenant, pour comprendre les mécanismes moléculaires
00:13:11.22pour cette dégradation de la réductase induite par les stérols,
00:13:14.15nous devons comprendre la structure de la protéine HMG CoA réductase.
00:13:18.05Et la structure du domaine de la réductase
00:13:20.14est en fait illustrée dans cette diapositive.
00:13:22.18Donc, l’HMG CoA réductase
00:13:24.16est constituée de deux domaines distincts.
00:13:26.28Elle possède un domaine N-terminal
00:13:29.06qui ancre la protéine dans les membranes du réticulum endoplasmique,
00:13:32.14ou le RE.
00:13:35.00Maintenant, ce domaine N-terminal,
00:13:36.29que nous appelons le domaine membranaire,
00:13:39.04contient huit régions membranaires.
00:13:42.05Et il est suivi par le deuxième domaine de l’HMG CoA réductase,
00:13:45.07que nous appelons le domaine catalytique.
00:13:47.24Donc, le domaine catalytique fait saillie dans le cytosol des cellules
00:13:51.24et contient toute l’activité enzymatique de l’HMG CoA réductase.
00:13:56.03En fait, une version tronquée de la réductase
00:13:59.29qui ne contient que le domaine catalytique
00:14:02.13peut complètement sauver la synthèse du mévalonate
00:14:06.28dans les cellules qui manquent de HMG CoA réductase.
00:14:10.13Donc, le domaine catalytique est à la fois nécessaire et suffisant
00:14:13.01pour la synthèse du mévalonate.
00:14:15.29Ce qui soulève alors la question,
00:14:17.28pourquoi cette protéine est-elle liée à la membrane ?
00:14:19.26Et il s’avère que la réductase
00:14:22.02est en fait une protéine liée à la membrane dès la levure.
00:14:25.18Donc, la fonction du domaine membranaire de la réductase
00:14:28.26a été illustrée dans cette première expérience
00:14:31.27qui a comparé la stabilité du domaine catalytique
00:14:35.08–qui, rappelons-le, contient toute l’activité enzymatique–
00:14:37.26à l’enzyme complète.
00:14:40.20Et encore une fois, une simple analyse pulse-chase
00:14:42.21a été utilisée pour surveiller la stabilité de ces deux protéines.
00:14:47.13Comme vous pouvez le voir dans le panneau de gauche,
00:14:49.03le domaine catalytique tronqué produit
00:14:53.14une protéine très stable qui… de manière importante,
00:14:57.08sa dégradation n’est pas influencée par les stérols.
00:14:59.20En revanche, la protéine complète — qui, encore une fois, contient le domaine membranaire —
00:15:03.07est moins stable, même en l’absence de stérols.
00:15:06.13Et vous pouvez voir que les stérols accélèrent nettement
00:15:09.25la dégradation de la HMG CoA réductase,
00:15:12.09ce qui indique que le domaine membranaire…
00:15:15.12la fonction du domaine membranaire
00:15:17.25est pour cette dégradation accélérée par les stérols ou induite par les stérols.
00:15:22.08Donc, ce que les études précédentes ont indiqué
00:15:25.12est que le domaine membranaire de la réductase
00:15:28.03est nécessaire et suffisant pour la dégradation accélérée par les stérols,
00:15:30.25et elles ont suggéré que le domaine membranaire,
00:15:33.16soit directement ou indirectement,
00:15:35.16peut détecter les niveaux intracellulaires de stérols.
00:15:38.00Et la détection entraîne, peut-être,
00:15:41.02un changement de conformation dans le domaine membranaire de la réductase
00:15:43.29qui rend la protéine sensible à une dégradation rapide.
00:15:48.14Et bien sûr, comme les statines bloquent la synthèse du cholestérol,
00:15:52.01les statines bloquent effectivement cette
00:15:54.22ce que nous appelons la dégradation associée au RE — ou ERAD —
00:15:57.08de l’HMG CoA réductase.
00:16:02.23Donc, une percée clé dans notre compréhension
00:16:04.23de l’ERAD de l’HMG CoA réductase
00:16:06.15est venue avec la découverte d’une paire de protéines
00:16:08.28– protéines de la membrane du RE —
00:16:10.23appelées Insig-1 et Insig-2.
00:16:14.15Ces protéines Insig, pour les besoins de cet exposé,
00:16:16.27sont très redondantes.
00:16:18.14Elles jouent des rôles redondants dans la dégradation, ou ERAD,
00:16:22.06de l’HMG CoA réductase.
00:16:24.00Elles sont identiques… elles sont environ 85% identiques,
00:16:26.23et ce sont des protéines hautement hydrophobes.
00:16:29.24Maintenant, le rôle de l’Insigs dans l’ERAD de l’HMG CoA réductase
00:16:34.28a été illustré pour la première fois dans cette expérience.
00:16:37.19Donc, ici encore, nous avons utilisé l’analyse par impulsion-chase
00:16:40.15pour mesurer la dégradation accélérée par les stérols
00:16:43.29de la réductase dans des cellules
00:16:47.02qui étaient soit transfectées avec des molécules de contrôle,
00:16:51.06appelées siRNAs,
00:16:53.05ou des cellules qui ont été transfectées avec des siRNAs
00:16:55.26qui conduiraient à la réduction de l’expression
00:16:58.13de Insig-1 et Insig-2.
00:17:02.07Et comme vous pouvez le voir dans le panneau de gauche,
00:17:04.13dans les cellules transfectées avec les siRNA de contrôle,
00:17:08.04les stérols accélèrent nettement la dégradation
00:17:12.07de l’HMG CoA réductase.
00:17:14.13Donc, les cercles ouverts sont des expériences menées en absence,
00:17:17.09et les cercles fermés sont des expériences menées
00:17:20.15en présence de stérols.
00:17:22.12Et ce que vous pouvez facilement voir, c’est que le knockdown de Insig-1 et Insig-2
00:17:26.23complètement abolit la dégradation accélérée par les stérols,
00:17:30.02indiquant que ces protéines
00:17:32.28jouent un rôle clé dans ce processus.
00:17:35.27Donc, notre prochaine question est,
00:17:38.02quel est le mécanisme
00:17:39.26par lequel les Insigs accélèrent la DERAD de l’HMG CoA réductase ?
00:17:47.09Alors, cette expérience…
00:17:48.21cette diapositive montre que les inhibiteurs du protéasome, le protéasome 26S,
00:17:53.21bloquent la dégradation de l’HMG CoA réductase induite par les stérols.
00:17:57.15Donc, comme vous pouvez le voir dans cette expérience…
00:18:00.18dans les deux premières voies, les stérols ont provoqué une dégradation marquée de la réductase,
00:18:04.17et cette dégradation est complètement bloquée
00:18:06.19lorsque ces cellules sont traitées avec l’inhibiteur du protéasome.
00:18:12.03Donc, avec… cela nous permet de créer un autre modèle
00:18:15.27dans lequel, encore une fois, le domaine membranaire de la réductase
00:18:18.25détecte directement ou indirectement
00:18:21.22les niveaux de stérols intracellulaires,
00:18:24.15Ce qui provoque la liaison de la réductase aux Insigs,
00:18:28.12et cette liaison aux Insigs entraîne des réactions qui font que la réductase
00:18:32.06est maintenant dégradée par le protéasome 26S.
00:18:37.22On sait maintenant que la plupart des substrats des protéasomes
00:18:41.00nécessitent leur ubiquitination préalable.
00:18:44.05L’ubiquitination est un processus par lequel
00:18:46.23la petite protéine ubiquitine devient attachée de manière covalente
00:18:50.16aux molécules de substrat.
00:18:52.08Et une fois qu’une chaîne d’ubiquitines
00:18:54.16est attachée aux substrats,
00:18:56.08elle devient reconnue par les protéasomes pour être dégradée.
00:19:00.25Maintenant, ceci est appelé polyubiquitination,
00:19:02.25et la polyubiquitination des protéines
00:19:05.14nécessite l’action d’au moins trois types d’enzymes différents.
00:19:07.29C’est illustré dans cette diapositive.
00:19:11.09Dans la première étape,
00:19:13.15laubiquitine devient activée
00:19:15.20de manière ATP-dépendante par une enzyme appelée E1,
00:19:19.11ou protéine activatrice d’ubiquitine.
00:19:22.15Dans l’étape suivante, l’ubiquitine est transférée de l’E1…
00:19:27.13à une autre enzyme appelée E2, ou enzyme conjuguant l’ubiquitine.
00:19:32.16Dans la dernière étape, l’E2 se combine avec une E3,
00:19:36.24ou ubiquitine ligase,
00:19:39.08qui à son tour est associée au substrat,
00:19:42.09présenté ici en vert.
00:19:44.11Ce que fait la E3, c’est qu’elle facilite le transfert de l’ubiquitine
00:19:47.27de l’enzyme conjuguant l’ubiquitine
00:19:50.00à un résidu lysine dans la protéine substrat,
00:19:53.08générant un substrat ubiquitiné.
00:19:57.28Maintenant, ce processus se produit de nombreuses fois,
00:20:00.02jusqu’à ce qu’une chaîne d’ubiquitine soit construite sur la protéine substrat.
00:20:06.02Qui peut maintenant être reconnue par les protéasomes pour être dégradée.
00:20:10.18Donc, considérant que ces protéines Insig
00:20:12.26sont nécessaires pour la dégradation de la réductase,
00:20:15.08et que la réductase est effectivement dégradée par les protéasomes,
00:20:19.02notre prochaine question est : la réductase est-elle ubiquitinée ?
00:20:23.20Cette question a trouvé une réponse dans cette expérience
00:20:26.11 montrée dans cette diapositive.
00:20:28.21Donc, ce que nous avons fait dans cette expérience, c’est que nous avons traité des cellules
00:20:31.15en l’absence et en présence de stérols
00:20:33.20et de l’inhibiteur de protéasome.
00:20:37.05Après ces traitements,
00:20:39.11nous immunoprécipitons la réductase
00:20:41.21puis nous sondons ces immunoprécipités pour la réductase totale,
00:20:43.20 montrée sur le panneau du bas,
00:20:45.18ou la réductase ubiquitinée.
00:20:49.07Donc, comme vous pouvez le voir dans la première voie,
00:20:51.01même si la réductase est tirée vers le bas dans ces expériences,
00:20:55.11nous ne voyons aucune réactivité avec l’ubiquitination.
00:20:58.14Cependant, les stérols provoquent l’ubiquitination de la réductase.
00:21:03.09Et cette ubiquitination est nettement augmentée
00:21:07.22si nous incluons également des inhibiteurs du protéasome.
00:21:09.27Donc, ce que cela nous indique, c’est que les stérols
00:21:12.16enfin provoquent l’ubiquitination de la réductase,
00:21:14.20et cette protéine ubiquitinée est maintenant dégradée par les protéasomes,
00:21:17.18comme l’indique la stabilité de la réductase ubiquitinée
00:21:21.21par ces inhibiteurs de protéasomes.
00:21:24.27Notre prochaine question est,
00:21:27.07les Insigs sont-ils nécessaires pour cette ubiquitination de la réductase induite par les stérols ?
00:21:32.16Et encore une fois, nous nous tournons vers les siRNAs.
00:21:35.08Les cellules ont été transfectées soit avec le siRNA de contrôle
00:21:38.18ou des siRNA contre Insig-1 et -2.
00:21:41.03Nous traitons ensuite ces cellules en absence ou en présence de stérols,
00:21:43.20puis nous sondons la réductase ubiquitée.
00:21:47.16Et comme vous pouvez le voir dans les deux premières voies,
00:21:49.10la réductase est bien ubiquitée en présence de stérols,
00:21:52.08et le knockdown de Insig-1 et Insig-2
00:21:56.02abolit complètement cette ubiquitination.
00:22:01.01Alors, cela nous permet maintenant de combler plus de lacunes dans notre modèle
00:22:04.07pour le ERAD médié par Insig de l’HMG CoA réductase.
00:22:09.14Maintenant, il s’avère qu’un sous-ensemble de molécules Insig
00:22:12.00s’associe réellement à un complexe ubiquitine ligase E3/E2.
00:22:16.27En outre, en présence de stérols,
00:22:20.15le domaine membranaire de la réductase
00:22:23.03détecte le stérol,
00:22:24.25et cette détection amène la réductase à se lier aux Insigs,
00:22:27.28et bien sûr ces Insigs
00:22:31.13pontent ensuite la réductase au complexe ubiquitine ligase E3/E2.
00:22:36.26Ce pontage entraîne ensuite l’ubiquitination de la réductase
00:22:40.00 au niveau de deux résidus lysine dans le domaine membranaire.
00:22:43.17Et cette ubiquitination entraîne ensuite le retrait de la réductase
00:22:46.17de la membrane du RE
00:22:50.09et sa dégradation ultérieure par les protéasomes,
00:22:52.22par un processus que nous ne sommes pas complètement…
00:22:55.07par un processus qui n’est pas complètement compris.
00:23:00.20Donc, en résumé, je vous ai dit aujourd’hui
00:23:03.16 que l’HMG CoA réductase est l’enzyme limitant la vitesse
00:23:06.07 dans la voie de synthèse du cholestérol,
00:23:08.01 et qu’elle est une cible de ces statines hypocholestérolémiantes.
00:23:11.26La réductase est contrôlée par un système de régulation par rétroaction très complexe
00:23:15.16
00:23:18.01qui est médié par le cholestérol et d’autres types de stérols.
00:23:20.18Et que les statines perturbent ce système de régulation en retour,
00:23:24.03en partie en bloquant cette ubiquitination
00:23:27.10et ERAD de l’HMG CoA réductase médiée par Insig.