Qu’est-ce que la spectroscopie de fluorescence ?

Qu’est-ce qu’un spectre de fluorescence ?

Fig. 1 : Un spectre d’excitation de fluorescence (bleu) et un spectre d’émission (violet) sont des images miroir l’un de l’autre

Les spectres de fluorescence à l’état stable sont ceux où les molécules, excitées par une source constante de lumière, émettent une fluorescence, et les photons émis, ou l’intensité, sont détectés en fonction de la longueur d’onde. On parle de spectre d’émission de fluorescence lorsque la longueur d’onde d’excitation est fixée et que la longueur d’onde d’émission est balayée pour obtenir un tracé de l’intensité en fonction de la longueur d’onde d’émission.

On parle de spectre d’excitation de fluorescence lorsque la longueur d’onde d’émission est fixée et que la longueur d’onde du monochromateur d’excitation est balayée. De cette façon, le spectre donne des informations sur les longueurs d’onde auxquelles un échantillon va absorber de manière à émettre à la seule longueur d’onde d’émission choisie pour l’observation. Cette technique est analogue au spectre d’absorbance, mais elle est beaucoup plus sensible en termes de limites de détection et de spécificité moléculaire. Les spectres d’excitation sont spécifiques à une seule longueur d’onde/espèce émettrice, contrairement au spectre d’absorption, qui mesure toutes les espèces absorbantes dans une solution ou un échantillon. Les spectres d’émission et d’excitation d’un fluorophore donné sont des images miroir l’un de l’autre. Généralement, le spectre d’émission se produit à des longueurs d’onde plus élevées (énergie plus faible) que le spectre d’excitation ou d’absorption.

Ces deux types de spectres (émission et excitation) sont utilisés pour voir comment un échantillon change. L’intensité spectrale et ou la longueur d’onde du pic peuvent changer avec des variantes telles que la température, la concentration ou les interactions avec d’autres molécules qui l’entourent. Cela inclut les molécules quencher et les molécules ou matériaux qui impliquent un transfert d’énergie. Certains fluorophores sont également sensibles aux propriétés de l’environnement du solvant, comme le pH, la polarité et certaines concentrations d’ions.