Propriétés physico-chimiques des nanoémulsions à base de lécithine obtenues par émulsification spontanée ou homogénéisation à haute pression

ARTIGO

Propriétés physico-chimiques des nanoémulsions à base de lécithine obtenues par émulsification spontanée ou homogénéisation à haute pression

Roselena S. Schuh# ; Fernanda Bruxel# ; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Des nanoémulsions composées d’un noyau d’huile triglycéride à chaîne moyenne stabilisé par des lécithines de colza ou de tournesol ont été préparées par émulsification spontanée et homogénéisation à haute pression. Ces nanoémulsions sont comparées à des formulations stabilisées par de la lécithine d’œuf. Les nanoémulsions obtenues par homogénéisation haute pression présentent une taille de gouttelettes plus importante (230 à 440 nm) par rapport à celles obtenues par émulsification spontanée (190 à 310 nm). Les potentiels zêta des émulsions étaient négatifs et inférieurs à -25 mV. L’inversion du potentiel zêta s’est produite entre pH 3,0 et 4,0. Ces résultats démontrent la faisabilité de la préparation d’émulsions lipidiques comprenant des lécithines de colza ou de tournesol par émulsification spontanée et homogénéisation à haute pression.

Mots clés : nanoémulsion ; lécithine ; parentérale ; homogénéisation à haute pression ; émulsification spontanée.

INTRODUCTION

Un régime de nutrition parentérale est essentiellement composé de macronutriments (acides aminés, glucides et lipides) et de micronutriments (vitamines, électrolytes et micro-éléments), sous la prescription d’un médecin en fonction de l’état, de l’âge et du poids du patient1. Les macronutriments lipidiques, administrés sous forme d’émulsions, sont des donneurs d’énergie, des fournisseurs d’acides gras essentiels et des transporteurs de vitamines liposolubles. Les acides gras contenus dans ces formulations ont une importance métabolique majeure, car ils sont des composants de la membrane cellulaire et jouent des rôles spécifiques dans la signalisation et le transport hormonal. De plus, ils sont des précurseurs des prostaglandines, des leucotriènes, des thromboxanes et des prostacyclines, qui modulent les processus inflammatoires, la fonction rénale et l’agrégation plaquettaire.Une carence en acides gras essentiels chez les prématurés au cours du développement cérébral entraîne des problèmes d’apprentissage et une déficience de la fonction visuelle, qui peuvent être irréversibles, même si une alimentation adéquate contenant des acides gras est fournie plus tard dans le développement2.

Les émulsions lipidiques parentérales sont des systèmes hétérogènes, constitués d’une phase huileuse dispersée de manière homogène dans une phase aqueuse (dispersante), par la présence d’un émulsifiant. Une petite taille de gouttelettes, généralement comprise entre 200 et 500 nm, caractérise les formulations, en raison du risque d’embolie dû à l’utilisation de particules plus grosses. Les émulsions doivent également présenter un pH physiologiquement compatible (autour de 7), une isotonicité, une faible viscosité et un potentiel zêta élevé (en module), afin d’éviter l’apparition de phénomènes d’instabilité.3

Les nanoémulsions lipidiques sont couramment employées dans les mélanges de nutrition parentérale totale, appelés systèmes 3-en-1, dans lesquels tous les macronutriments et micronutriments sont ajoutés à une poche d’éthylvinylacétate (EVA). Cependant, ces mélanges présentent une certaine instabilité physique liée à la présence d’électrolytes et d’autres composants, qui peuvent précipiter ou interagir avec les gouttelettes de l’émulsion. La précipitation du calcium et du phosphate est largement rapportée dans la littérature. De plus, les ions divalents (tels que le calcium et le magnésium) peuvent interférer avec le potentiel zêta de l’émulsion et induire une agrégation/floculation des gouttelettes lipidiques, suivie d’une coalescence. Ce phénomène est très grave, car toute gouttelette de plus de 5 µm de diamètre qui pénètre dans la circulation sanguine peut provoquer une embolie graisseuse.4,5

Les caractéristiques physiques et la stabilité conséquente des émulsions lipidiques sont fortement liées à leur méthode de production et à leur composition.3,6 Les méthodes de production sont diverses et peuvent nécessiter plus d’une étape pour produire une émulsion avec une taille de gouttelette réduite. Un homogénéisateur à grande vitesse (Ultraturrax®) peut d’abord créer une émulsion grossière, par exemple. La réduction de la taille des gouttelettes peut ensuite être obtenue par homogénéisation à haute pression, microfluidisation ou ultrasonication.7-9 Parmi les méthodes qui ne nécessitent pas de prétraitement, il y a l’émulsification spontanée, principalement utilisée dans les études de formulation et facilement réalisée à l’échelle du laboratoire, car il n’est pas nécessaire d’utiliser un équipement sophistiqué.10

Le tableau 1 montre la composition d’émulsions lipidiques intraveineuses types disponibles dans le commerce. Outre les composants décrits, les formulations doivent répondre aux exigences des produits injectables.11

La phase huileuse des émulsions parentérales est composée de triglycérides à longue chaîne (LCT), qui peuvent être combinés avec des triglycérides à chaîne moyenne (MCT), comme indiqué dans le tableau 1. Les TCL comprennent une grande variété d’huiles, comme l’huile de tournesol, de ricin, d’olive ou, plus couramment, de soja. Ces huiles contiennent toutes des chaînes d’acides gras de plus de 12 atomes de carbone. Les TCM sont obtenus par estérification des acides gras de l’huile de noix de coco. Les émulsifiants de choix pour la stabilisation des émulsions injectables sont les lécithines, car elles sont biocompatibles et biodégradables. Les lécithines sont des mélanges naturels de phospholipides polaires et neutres, obtenus à partir de sources animales ou végétales.12 La composition phospholipidique des lécithines de sources végétales peut être variable en raison de l’extraction, de la culture et d’autres conditions de traitement.13 Elles contiennent principalement des phospholipides amphotères, tels que la phosphatidylcholine et la phosphatidyléthanolamine, mais des phospholipides négatifs peuvent également être présents.

Les émulsions lipidiques disponibles dans le commerce pour la nutrition parentérale sont le plus souvent composées de lécithine de jaune d’œuf ou, rarement, de lécithine de soja (Solipid® E&S). Malgré les nombreux avantages de la supplémentation en lipides, des rapports font état d’effets cliniques indésirables liés à une supplémentation à long terme, en raison de limitations métaboliques et de réactions immunitaires chez les patients gravement malades.14,15 Les réactions indésirables aux émulsions lipidiques parentérales seraient liées à la présence de lécithines de soja et de jaune d’œuf.16-18 Les interactions entre les allergies médicamenteuses et alimentaires peuvent entraîner une série de réactions indésirables, allant des troubles gastro-intestinaux à l’anaphylaxie.19

Dans ce contexte, la recherche de matières premières alternatives se poursuit afin de trouver des substituts hypoallergéniques plus sûrs pour l’administration parentérale chez les patients. Ce travail priorise la recherche de différentes lécithines dans le but de trouver de nouvelles alternatives pour les émulsions lipidiques destinées à la nutrition parentérale, voire comme vecteurs de médicaments, afin de fournir les options les plus sûres pour les patients (notamment les prématurés) présentant une hypersensibilité aux émulsifiants à base d’œuf ou de soja. Nous avons cherché à développer des nanoémulsions lipidiques parentérales stabilisées par des lécithines de colza ou de tournesol, et les avons comparées à des nanoémulsions contenant de la lécithine d’œuf. En outre, la préparation par émulsification spontanée est comparée à l’homogénéisation à haute pression, couramment utilisée pour la production industrielle d’émulsions lipidiques parentérales.

MATERIAUX ET METHODES

Chimiques et réactifs

Les lécithines de MCT, d’huile de soja et de jaune d’œuf (Lipoid E80®), de colza (Lipoid R100®) et de tournesol (Lipoid H100®) ont été obtenues auprès de Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Allemagne), qui a aimablement fait don des lécithines de colza et de tournesol. Le glycérol et l’éthanol ont été obtenus auprès de Merck (Brésil) et Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), respectivement. L’eau ultra-pure a été obtenue à partir d’un appareil Milli-Q® (Millipore, Billerica, USA).

Préparation des nanoémulsions

Les émulsions lipidiques ont été préparées en triplicata par deux méthodes : l’émulsification spontanée et l’homogénéisation à haute pression. Les formulations obtenues par émulsification spontanée ont été préparées selon une procédure décrite précédemment.10,20 Brièvement, l’huile de soja a été mélangée avec du MCT, de la lécithine et de l’éthanol. Le glycérol a été dissous dans l’eau, dans laquelle la phase éthanolique a été lentement ajoutée sous agitation magnétique modérée pendant 30 min. Le solvant a ensuite été éliminé par distillation sous pression réduite dans un évaporateur rotatif. Les formulations obtenues par homogénéisation à haute pression ont été préparées comme décrit précédemment.21 Tout d’abord, la lécithine a été dispersée dans de l’eau contenant du glycérol et mélangée sous agitation magnétique à 40 ºC, jusqu’à obtention d’une phase aqueuse homogène. La phase huileuse était constituée d’huile de soja et de MCT. Les deux phases huile et eau ont été mélangées sous agitation magnétique (15 min, à température ambiante) pour obtenir une émulsion grossière. Les émulsions grossières ont ensuite été mélangées à 9500 rpm pendant 2 min en utilisant un mélangeur IKA® Ultra-Turrax T8 (IKA® Works Inc., NC, USA) pour former des pré-émulsions brutes, qui ont été individuellement soumises à une homogénéisation à haute pression (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Canada) à 750 bar (10 000 psi) pendant 10 cycles pour produire l’émulsion finale. Le pH de toutes les formulations a été ajusté à 8,0 avec une solution de NaOH 0,01 mol L-1. Les émulsions ont été stockées à 4 ºC. Les formulations et leurs constituants sont indiqués dans le tableau 2.

Caractérisation physico-chimique des nanoémulsions

Les valeurs de pH des formulations ont été déterminées directement dans les échantillons juste après leur préparation, à l’aide d’un potentiomètre calibré (Digimed, São Paulo, Brésil) à température ambiante. La taille moyenne des gouttelettes et l’indice de polydispersité ont été mesurés par spectroscopie de corrélation de photons (PCS) et le potentiel zêta a été déterminé par mobilité électrophorétique, à l’aide d’un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, UK) à 25ºC. Pour ces mesures, les nanoémulsions ont été diluées dans une solution de NaCl à 1 mmol L-1 dans la gamme de pH de 2,0 à 8,0 unités. La viscosité a été évaluée par viscosimétrie capillaire à 25 ºC (constante du viscosimètre, k = 0,0212), à 25 ± 0,1 ºC. On a enregistré le temps, en secondes, pour que le liquide s’écoule du repère supérieur au repère inférieur dans un tube capillaire. Toutes les formulations ont été analysées en triplicata.

Analyse morphologique

L’examen morphologique a été réalisé par microscopie électronique à transmission (MET). Une goutte de la nanoémulsion a été placée sur une grille de cuivre recouverte de carbone (200 mesh), colorée en négatif avec une solution d’acétate d’uranyle à 2,0 %, et laissée à sécher pendant 24 heures avant examen. Un instrument JEM-1200 EXII (JEOL, Tokio, Japon), fonctionnant à 80 kV, a été utilisé.

RESULTATS ET DISCUSSION

Dans la présente étude, nous développons des émulsions lipidiques destinées à la nutrition parentérale ou au transport de médicaments, stabilisées par deux lécithines obtenues à partir de sources végétales (colza (R) et tournesol (S)), comme alternatives à la lécithine de jaune d’œuf (E), un stabilisateur traditionnel pour les émulsions parentérales. Pour comparer les nouvelles formulations aux traditionnelles, tous les autres composants de l’émulsion ont été maintenus à des concentrations similaires à celles des émulsions lipidiques commerciales. Ce travail compare également deux méthodes de production différentes : l’émulsification spontanée et l’homogénéisation à haute pression.

Le tableau 3 présente les propriétés physico-chimiques des nanoémulsions obtenues. Les formulations obtenues par émulsification spontanée présentent une taille moyenne de gouttelettes de 220 à 300 nm, déterminée par PCS. En théorie, il s’agit d’une plage de stabilité élevée de l’émulsion.11,22,23 Au fur et à mesure que la taille des gouttelettes est réduite, le taux d’auto-diffusion augmente jusqu’à un point où de très petites gouttelettes peuvent être empêchées de crémer par mélange diffusionnel.7,23 Les nanoémulsions contenant de la lécithine de colza ou de tournesol présentent une taille moyenne de gouttelettes plus petite que celles contenant de la lécithine de jaune d’œuf. Des résultats similaires ont été décrits pour des nanoémulsions obtenues par la même méthode, composées uniquement de MCT, comme phase huileuse, et stabilisées par 2 % (m/m) de lécithine d’œuf.24 Sur la base de ces données, on pourrait conclure qu’une concentration de 1,2 % serait suffisante pour émulsifier le mélange d’huile de soja, de MCT et d’eau. Cependant, bien qu’une petite taille de gouttelettes et un faible indice de polydispersité aient été obtenus, les émulsions ne sont pas restées physiquement stables pendant plus d’une semaine après leur préparation, après quoi la séparation des phases (coalescence) a pu être observée visuellement. Le processus de coalescence est un phénomène d’instabilité irréversible, puisque les gouttelettes d’huile perdent leurs interfaces et fusionnent en gouttelettes plus grosses.25

La composition qualitative et quantitative des nanoémulsions, en plus du type d’émulsifiant et de la méthode d’émulsification, peut influencer directement la taille des gouttelettes.7,23 Une deuxième méthode a donc été testée pour la préparation des nanoémulsions. L’homogénéisation à haute pression est couramment utilisée dans l’industrie pharmaceutique pour la production de telles formulations, mais à une échelle industrielle. Parmi les différentes méthodes disponibles pour l’émulsification, cette méthode est préférée en raison de son efficacité à désagréger les gouttelettes. Il s’agit d’une méthode à haute énergie, où la réduction de taille est obtenue en forçant une émulsion grossière sous haute pression à travers une valve d’homogénéisation, déformant et réduisant ainsi la taille des gouttelettes26. L’émulsification spontanée est une méthode peu coûteuse, facile et fiable, et elle est généralement utilisée dans les études expérimentales au lieu d’un homogénéisateur à haute pression, qui est beaucoup plus complexe et coûteux.

Comme le montre le tableau 3, l’homogénéisation à haute pression a permis d’obtenir des tailles de gouttelettes plus importantes dans les nanoémulsions comprenant de la lécithine de colza (296 ± 18 nm) ou de tournesol (417 ± 25 nm), par rapport à la méthode précédente, et par rapport aux émulsions témoins œuf-lécithine (243 ± 12 nm). Néanmoins, il faut souligner que, même si l’homogénéisation à haute pression a été moins efficace dans la fragmentation des gouttelettes, elle a conféré une plus grande stabilité aux formulations. Contrairement aux émulsions obtenues par émulsification spontanée, celles-ci étaient visuellement stables pendant au moins 30 jours. Ces résultats confirment l’importance de la méthode de préparation pour conférer une stabilité à l’émulsion.

Envisageant des applications intraveineuses, la distribution de taille des gouttelettes d’émulsion lipidique peut être encore plus importante que la taille moyenne des gouttelettes. Une petite population de grosses gouttelettes d’huile peut être suffisante pour provoquer une embolie graisseuse chez les patients.4,5 Les distributions de taille des gouttelettes des formulations préparées sont présentées dans la figure 1.

Dans la figure 1, deux populations sont observées dans les formulations composées de lécithine de colza (obtenue par émulsification spontanée, figure 1C) et de lécithine de tournesol (obtenue soit par émulsification spontanée, soit par homogénéisation à haute pression, figures 1E et 1F). Par conséquent, un indice de polydispersité supérieur à 0,20 est obtenu pour ces formulations.

La stabilité des émulsions peut être corrélée à la composition et aux propriétés de leur film interfacial (lécithine), car celui-ci détermine le potentiel zêta des formulations et la répulsion entre les gouttelettes, qui est l’un des mécanismes de stabilisation des émulsions.27 La lécithine est un mélange hétérogène de phospholipides ; son hétérogénéité est extrêmement bénéfique en raison de la fluidité du film interfacial, comparée à celle d’un phospholipide pur.28 Les principaux phospholipides des mélanges de lécithine sont la phosphatidylcholine et la phosphatidyléthanolamine, qui ne sont pas chargées au pH physiologique (7,4). De plus petites quantités de lipides acides, comme le phosphatidylinositol, la phosphatidylsérine et le phosphatidylglycérol, peuvent également être présentes. Ces lipides sont ionisés à pH 7,0 et induisent une charge de surface négative sur les gouttelettes de l’émulsion, ce qui contribue à leur stabilité. Toute substance ajoutée qui interfère avec cette charge est susceptible d’altérer la stabilité du système.29 Même si la lécithine de qualité parentérale est hautement purifiée, elle contient toujours une petite quantité d’autres phospholipides, comme le montre le tableau 4, qui décrit la composition des trois matières premières de lécithine utilisées dans cette étude.

Comme le montre le tableau 3, un potentiel zêta (valeur du module) plus faible est observé pour les nanoémulsions composées de lécithine de colza ou de tournesol et obtenues par émulsification spontanée. Cependant, aucune différence n’est observée dans les potentiels zêta des nanoémulsions produites par homogénéisation à haute pression. Ces résultats indiquent que le principal facteur affectant le potentiel zêta est la méthode de préparation. Bien que notre groupe ait optimisé les deux méthodes, les conditions expérimentales doivent généralement être ajustées, en tenant compte de la composition des formulations. Des paramètres tels que le nombre de cycles et la pression peuvent être modifiés pour obtenir les propriétés physico-chimiques souhaitées des formulations finales.30,31

Le potentiel zêta des nanoémulsions dépend également de l’ionisation de l’émulsifiant. Une réduction de la charge résultante (en module) de 40 mV à moins de 25 mV peut augmenter les taux de floculation et de coagulation.32 Le potentiel zêta et la taille moyenne des gouttelettes des nanoémulsions composées de différentes lécithines et produites par différentes méthodes d’émulsification ont été évalués à dans la gamme de pH de 2,0 à 8,0. Les résultats sont présentés dans la figure 2.

La charge de surface de toutes les formulations diminue jusqu’à zéro entre pH 3,0 et 4,0, comme cela a été observé précédemment pour Intralipid®, une émulsion de triglycérides stabilisée par la lécithine d’œuf25. Le potentiel zêta dépend du pH, puisque H+ est un ion déterminant le potentiel sur les surfaces phospholipidiques, avec un pH isoélectrique de 3,1.33 Une réduction du pH entraîne une diminution (moins négative) du potentiel zêta et une vitesse de floculation plus rapide.34 La taille moyenne des gouttelettes montre une petite augmentation au pH d’inversion du potentiel zêta. D’après la figure 3, on peut conclure que le pH des nanoémulsions doit de préférence être supérieur à 7,0, car un plateau est atteint à cette valeur de pH, où une répulsion maximale entre les gouttelettes d’huile est observée.

Enfin, la morphologie des gouttelettes d’huile des nanoémulsions préparées par homogénéisation haute pression a été examinée par TEM. La figure 3 révèle des particules homogènes et sphériques, montrant que les gouttelettes de l’émulsion ont une taille moyenne de gouttelettes de l’ordre du nanomètre. Ces résultats corroborent l’analyse précédente de la taille des gouttelettes.

Les nanoémulsions sont des systèmes à faible viscosité avec un comportement newtonien. L’évaluation de la viscosité des émulsions est cruciale, car l’administration intraveineuse d’émulsions à haute viscosité peut être très douloureuse pour le patient.23,32 Les nanoémulsions composées de différentes lécithines présentent des viscosités similaires. Comme prévu, aucune relation entre la taille moyenne des gouttelettes et la viscosité des nanoémulsions n’est observée, puisque toutes les formulations ne contenaient que 10 % de noyau d’huile.35 En revanche, certaines différences de viscosité sont observées pour les formulations obtenues par les différentes méthodes de préparation : l’émulsification spontanée a produit des émulsions légèrement plus visqueuses.

Il convient de mentionner que les compositions des nanoémulsions étudiées dans ce travail sont basées sur celles des nanoémulsions commerciales utilisant la lécithine d’œuf comme émulsifiant. L’utilisation d’un émulsifiant différent peut nécessiter une optimisation de sa concentration et/ou des conditions d’émulsification. Les nanoémulsions injectables commerciales composées de lécithine de soja (Solipid®) nécessitent une concentration de 1,5 % de l’émulsifiant, par exemple. Des co-émulsifiants supplémentaires sont parfois utilisés pour stabiliser les émulsions et favoriser une moindre polydispersité et des gouttelettes plus petites. Cependant, leur application est limitée aux émulsions lipidiques utilisées comme vecteurs de médicaments, car de petites quantités de ces formulations sont administrées à cette fin : les co-émulsifiants ne sont pas fréquemment utilisés dans les émulsions destinées à la nutrition parentérale, en raison des volumes élevés de ces formulations administrées et des problèmes de sécurité, notamment dans le cas des prématurés. L’oléate de sodium est couramment utilisé pour stabiliser les formulations d’émulsions lipidiques injectables,36 agissant comme un tensioactif anionique et un agent solubilisant.27

CONCLUSIONS

Les résultats démontrent la faisabilité de la préparation d’émulsions lipidiques injectables composées de lécithines de colza ou de tournesol par émulsification spontanée et homogénéisation à haute pression, comme alternatives aux nanoémulsions traditionnelles à base d’œuf et de lécithine pour les patients sensibles aux dérivés de l’œuf. D’autres études devraient être menées pour optimiser les conditions d’émulsification afin d’améliorer la stabilité à long terme des formulations.

ACKNOWLEDGEMENTS

Les auteurs tiennent à remercier le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) pour son soutien financier et Lipoid GmbH pour les matériaux fournis.

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Reçu le 03/02/2014 ; accepté le 17/04/2014 ; publié sur le web le 15/07/2014

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