L’ingénierie des ribosomes révèle l’importance de l’autonomie de l’ARNr 5S pour l’assemblage des ribosomes

Construction des plasmides

Tous les plasmides ont été construits par assemblage Gibson50, avec les squelettes plasmidiques préparés par PCR inverse ou digestion par nucléase de restriction et les inserts générés par PCR ou synthétisés chimiquement par Integrated DNA Technologies. Les plasmides codant pour l’ARNr ont été initialement électroporés dans des cellules E. coli POP2136 (les génotypes de toutes les souches utilisées dans cette étude sont énumérés dans le tableau supplémentaire 1) et les transformants ont été récupérés sur des plaques LB complétées par les antibiotiques appropriés ; les plaques ont été incubées à 30 °C pour empêcher l’expression des gènes de l’ARNr contrôlés par le promoteur lambda PL31. Tous les autres plasmides ont été transformés et propagés dans la souche E. coli JM109 et cultivés à 37 °C dans un milieu LB complété au besoin par 100 μg/ml d’ampicilline (Amp), 50 μg/ml de kanamycine (Kan) ou 50 μg/ml de spectinomycine (Spc).

Construction du plasmide ptRNA100

Le squelette du plasmide incluant l’origine de réplication pA15 et le gène de résistance Spc, a été amplifié par PCR à partir du plasmide ptRNA6751 en utilisant les amorces NA1 et NA2 (toutes les amorces sont listées dans le tableau supplémentaire 4). Le groupe de gènes de l’ARNt (codant pour le tRNAGlu, le tRNAAla, le tRNAIle, le tRNATrp et le tRNAAsp), sous le contrôle du promoteur Ptac et du terminateur T1, a été synthétisé sous forme de gBlock (Integrated DNA Technology). Le plasmide pTRNA100 a été généré par assemblage Gibson. La structure du plasmide a été vérifiée par digestion de restriction et la présence du cluster d’ARNt né sur le plasmide a été confirmée par amplification par PCR en utilisant les amorces NA3 et NA4 et par séquençage.

Construction des plasmides pDH42, pDH39, et pCH84

Les constructions portant le gène hybride 23S-cp5S de l’ARNr ont été générées sur la base du plasmide pAM55229, qui héberge l’opéron rrnB de l’ARNr d’E. coli. Le gène de l’ARNr 5S a été supprimé par PCR inverse à l’aide des amorces NA17 et NA18, qui abritent le site de restriction Xho1, digestion du produit de la PCR par Xho1, et ligature de l’ADN. La mutation de résistance à Ery A2058G a ensuite été introduite dans le gène de l’ARNr 23S par mutagenèse dirigée en utilisant le kit de mutagenèse dirigée QuikChange Lightning Multi Site (Agilent Technologies) avec l’amorce NA7. Le plasmide résultant, pAM552Δ5S a été utilisé pour introduire les gènes de l’ARNr cp5S avec des linkers à trois endroits différents dans le gène de l’ARNr 23S.

La préparation de la séquence d’ADNr cp5S pour l’intégration dans l’ADNr 23S a été effectuée dans une seule réaction PCR où les paires d’amorces NA8/NA9 (pour les constructions DH39 et DH42) ou NA26 et NA27 (pour la construction CH84) (100 nM chacune) qui hébergeaient l’insert d’ADNr cp5S, ont été combinées avec des paires d’amorces (250 nM chacune) introduisant des lieurs de séquence aléatoires, dont la taille varie de 0 à 3 nt, aux jonctions 23S-cp5S « gauche » et « droite », comme suit : NA10-NA13 et NA14-NA17 pour le DH39 ; NA18-NA21 et NA22-NA25 pour le DH42 ; NA28-NA31 et NA32-NA35 pour le CH84.

Pour la génération des bibliothèques de plasmides DH39, DH42 et CH84, le plasmide pAM552Δ5S a été ouvert par PCR inversée en utilisant les paires d’amorces NA36/NA37, NA38/NA39 et NA40/NA41, respectivement. Les inserts d’ADNr cp5S ont été introduits dans les squelettes plasmidiques obtenus par PCR inversée par des réactions d’assemblage de Gibson. Les produits de la réaction ont été transformés en cellules E. coli POP2136 par électroporation et les transformants ont été récupérés sur des plaques de gélose LB/Amp cultivées à 30 °C (conditions qui empêchent l’expression de l’ARNr porté par le plasmide). Chaque bibliothèque contenait au moins 3 fois plus de clones que la diversité théorique estimée de 7225 variants. Les colonies ont été lavées des plaques LB, les bibliothèques de plasmides ont été extraites et stockées.

Remplacement du ptRNA67 par le ptRNA100

La souche E. coli SQ171 qui manque d’allèles d’ARNr chromosomiques et porte le plasmide pCSacB comme source des gènes d’ARNr et le plasmide ptRNA67 comme source des gènes d’ARNt chromosomiques manquants32,52, a été utilisée comme souche hôte de départ. Afin de remplacer le plasmide ptRNA67 par le ptRNA100, les cellules SQ171 ont d’abord été transformées avec le ptRNA-Amp (fourni par Michael O’Connor, Université du Missouri, Kansas City), qui ressemble au ptRNA67 mais confère une résistance à l’Amp et contient l’origine de réplication pBR322. Les transformants ont ensuite été débarrassés du plasmide ptRNA67 par passage dans un milieu LB supplémenté en Amp et Kan pendant ~100 générations. La perte du plasmide ptRNA67 a été vérifiée par la sensibilité des clones à Spc lors du repiquage. La souche résultante a ensuite été transformée avec ptRNA100 et ensemencée sur une gélose LB supplémentée avec Spc et Kan. Les transformants ont été passés pour ~100 générations dans des milieux LB supplémentés avec Spc et Kan. La perte du plasmide ptRNA-Amp a été vérifiée par la sensibilité des clones individuels à l’Amp, révélée par l’ensemencement de répliques. La présence de ptRNA100 et l’absence de ptRNA67 ont été vérifiées en outre par PCR et digestion de restriction des plasmides totaux préparés à partir du clone résultant.

Inactivation du gène recA dans les cellules SQ171/ptRNA100

Le gène recA dans la souche SQ171/ptRNA100 a été inactivé par transduction du phage P1. La souche donneuse BW25113 recA::cat a d’abord été préparée par la procédure conventionnelle de recombinaison52 en utilisant la cassette de résistance au chloramphénicol (Chl) du plasmide pKD352. La cassette a été amplifiée par PCR à l’aide des amorces NA42 et NA43. Le fragment PCR a été transformé dans la souche BW25113 portant le plasmide pDK46 exprimant la recombinase rouge. Après vérification de l’intégration de la cassette cat et durcissement de pKD46, les cellules BW25113 recA::cat ont été utilisées comme donneurs pour la transduction des phages. La transduction des phages P1 a été réalisée selon le protocole standard53 sauf que l’incubation de récupération a été prolongée de 1 à 3 h avant de plaquer les transductants sur des plaques LB/agar supplémentées en Kan, Spc et 15 μg/ml de Chl. Pour l’excision de la cassette cat, la souche résultante a été transformée avec le plasmide pZFLP-TetR qui code pour l’enzyme flippase et les transformants ont été plaqués sur la plaque LB/agar supplémentée avec Kan, Spc et 2,5 μg/ml de tétracycline (Tet). L’élimination du gène cat a été confirmée par PCR et par la sensibilité Chl des clones. Ensuite, le plasmide pZFLP-TetR a été éliminé en passant les cellules pour ~100 générations dans un milieu LB complété avec Kan, Spc, et les clones résultants ont été testés pour la sensibilité à Tet. La souche résultante a été nommée SQA18 (tableau supplémentaire 1).

Introduction des bibliothèques 23S-cp5S dans les cellules SQA18

Les bibliothèques de plasmides extraites des cellules POP2136 ont été transformées dans les cellules SQA18 par électroporation. Après 2 h de récupération à 37 °C, les transformants ont été plaqués sur des plaques de gélose LB/Amp qui ont ensuite été incubées pendant une nuit à 37 °C. Les colonies ont été lavées des plaques de gélose et 0,01 A600 (~106 cellules) ont été placées dans un volume de 2 ml de milieu LB complété par 150 μg/mL d’Ery et 0,25% de saccharose. Après une croissance de 16 h, les cellules ont été placées sur des plaques de gélose contenant de l’Amp, 1 mg/ml d’Ery et 5 % de saccharose. Les plaques ont été incubées pendant 48 h à 37 °C. Des colonies viables sont apparues avec les bibliothèques DH42 et CH84, mais pas avec la bibliothèque DH39. Plusieurs des colonies apparues sur les plaques ont été testées par PCR de colonie pour la présence de l’ADNr 23S-cp5S en utilisant les paires d’amorces NA44/NA45 pour la construction DH42 et les amorces NA46/NA47 pour la construction CH84. L’absence du gène de l’ARNr 5S wt a été vérifiée par PCR de colonie en utilisant les amorces NA48 et NA49.

Sélection des lieurs d’ARNr 23S-cp5S préférés

La bibliothèque totale de plasmides DH42 isolée des cellules POP2136 a été transformée en cellules SQA18 et plaquée sur des plaques LB/Amp comme décrit ci-dessus. Les colonies (~50 000) ont été lavées de la plaque et le plasmide total a été extrait de ~109 cellules et utilisé comme bibliothèque de présélection.

Approximativement 109 cellules ont ensuite été soumises à la procédure d’échange de plasmide. Plus précisément, elles ont été placées dans un volume de 20 ml de milieu LB complété par 150 μg/mL d’Ery et 0,25% de saccharose. Après une croissance de 4 h, les cellules ont été placées sur des plaques de gélose contenant de l’Amp, 1 mg/ml d’Ery et 5 % de saccharose. Les plaques ont été incubées pendant 48 heures à 37 °C. Les colonies (~50 000) ont été lavées de la plaque. Le plasmide total extrait de ces cellules représentait la bibliothèque de post-sélection.

L’ADNr cp5S flanqué de séquences d’ADNr 23S et de lieurs a été amplifié par PCR à partir des préparations plasmidiques des bibliothèques de présélection et de post-sélection en utilisant les amorces NA50 et NA51. Les bibliothèques PCR ont été soumises à un séquençage de nouvelle génération.

Le facteur d’enrichissement en plis pour chaque combinaison de linkers a été calculé selon la procédure suivante. Après avoir rogné l’adaptateur, la totalité de la séquence de l’ARNr cp5S, à l’exception des 4 nucléotides terminaux à chaque extrémité, a été éliminée pour réduire le nombre de faux variants de séquence apparus en raison d’erreurs de séquençage dans la séquence codante 5S. Les motifs de séquence résultants ont été comptés dans les bibliothèques de pré et post-sélection et la fréquence de la fraction de chaque variant de liaison a été calculée.

Préparation de l’ARN cellulaire total

Des cultures de nuit des souches E. coli POP2136 ou SQA18 ont été cultivées à 30 °C ou 37 °C, respectivement, dans un milieu LB/Amp. Les cultures ont été diluées au 1:100 dans 2 ml de milieu frais et cultivées à 37 °C jusqu’à A600 ~ 0,5. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (5000 × g, 1 min) et remises en suspension dans 100 μl de tampon de lyse . Après ajout ultérieur de 400 μl de tampon d’extraction (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) et incubation pendant 5 min à température ambiante, l’ARN total a été extrait par extraction au phénol/chloroforme. L’ARN a été précipité à l’éthanol, le culot d’ARN a été lavé avec 1 ml d’éthanol à 70%, dissous dans de l’eau exempte de RNase, congelé instantanément et stocké à -80 °C.

Analyse en gradient de saccharose des ribosomes et des polysomes

Des cultures d’E. coli de nuit ont été diluées dans 50 ml de milieu LB/Amp et cultivées jusqu’à A600 ~ 0,5. Du Chl a été ajouté à une concentration finale de 125 μg/ml et après 5 min d’incubation, les cellules ont été récoltées par centrifugation (5000 × g, 10 min, 4 °C). Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans un tampon de lyse glacé (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml de lysozyme, 0,25 % de désoxycholate de sodium et 2U de DNase I sans RNase RQ1). Les cellules ont été lysées par trois cycles de congélation-décongélation. Les lysats ont été clarifiés par centrifugation (20 000 × g, 15 min, 4 °C) et 20 unités A260 de lysat ont été chargées sur 12 mL de gradient linéaire de saccharose 10-40 % dans un tampon 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-mercaptoéthanol. Les gradients ont été centrifugés (3 h, 4 °C) à 39 000 tr/min dans un rotor SW41 (Beckman). Les gradients ont été fractionnés à l’aide d’un fractionneur (BioComp), en enregistrant l’absorbance à 254 nm. Les fractions correspondant aux sous-unités 50S, aux ribosomes 70S et aux polysomes ont été regroupées. L’ARN a été isolé par extraction phénol/chloroforme et précipitation à l’éthanol.

Isolation des ribosomes 70S et des sous-unités ribosomales

Pour isoler les ribosomes à couplage serré54, des cultures E. coli d’une nuit ont été diluées dans 1 L de milieu LB/Amp et cultivées jusqu’à A600 ~ 0,5. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (5 000 g, 15 min, 4 °C), remises en suspension dans le tampon A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-mercaptoéthanol, 10 U/ml de DNase I sans RNase RQ1), et lysées à l’aide d’une presse française à 10 000 psi. Les lysats ont été clarifiés par centrifugation dans un rotor JA25-50 (Beckman) à 13 000 rpm pendant 30 min à 4 °C et les surnageants ont été chargés sur 10 ml de coussin de saccharose 1,1 M préparé dans un tampon contenant 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 et 6 mM β-mercaptoéthanol, dans des tubes de centrifugation Quick-Seal de 35 ml (Beckman). Les ribosomes ont été culotés par centrifugation pendant 16 h à 36 000 rpm (4 °C) dans un rotor Ti70 (Beckman). Le culot de ribosomes a été remis en suspension dans le tampon B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl et 6 mM β-mercaptoéthanol) et 100 unités A260 ont été chargées sur un gradient de saccharose 10-40% préparé dans le tampon B dans les tubes d’un rotor SW27 (Beckman). Les gradients ont été centrifugés pendant 21 h à 20 000 rpm (4 °C) dans un rotor SW27, fractionnés à l’aide d’un fractionneur à gradient (BioComp) et les fractions contenant les ribosomes 70S et les sous-unités ribosomiques 50S ont été regroupées séparément. Le matériel a été concentré en utilisant des concentrateurs Vivaspin de 2 ml (Sartorius) avec une membrane en triacétate de cellulose et récupéré dans un tampon de stockage des ribosomes (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoéthanol). Des aliquotes de ribosomes et de sous-unités ribosomales ont été congelés au flash et conservés à -80 °C. Si nécessaire, l’ARNr a été isolé par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l’éthanol.

Pour l’isolement des sous-unités 50S à partir des ribosomes 70S, 130 pmol de ribosomes, préparés comme décrit ci-dessus mais concentrés par granulation et stockés dans le tampon de stockage des ribosomes (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoéthanol) ont été dilués dans le tampon D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-mercaptoéthanol) pour atteindre une concentration finale de 1,5 mM de MgCl2. Les sous-unités ribosomales ont été séparées par centrifugation dans des gradients de saccharose 10-40% préparés dans le tampon D qui contenait 1,5 mM de MgCl2. Les gradients ont été centrifugés pendant 16 heures à 27 000 rpm (4 °C) dans un rotor SW27 (Beckman), fractionnés, concentrés et récupérés dans le tampon de stockage des ribosomes, comme décrit ci-dessus. Les aliquots ont été congelés instantanément et stockés à -80 °C.

Analyse par CL-MS/MS des protéines ribosomiques

La composition protéique des ribosomes 70S et des sous-unités ribosomiques 50S wt et mutants à couplage serré, préparés comme décrit ci-dessus, a été déterminée par spectrométrie de masse quantitative55. Les préparations ribosomales ont été mélangées dans un rapport molaire de 1:1 avec des ribosomes wt marqués par SILAC contenant de l’arginine marquée en masse (Arg6 : 6HN4O2 et de la lysine (Lys4 : C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Allemagne). Les protéines ribosomales ont été digérées avec la trypsine (Sigma) ou la protéase Lys-C (Wako, USA). Les peptides résultants ont été fractionnés et analysés par LC-MS/MS en utilisant le LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). L’identification des protéines et l’analyse de quantification ont été réalisées à l’aide de Maxquant v1.5.6.056 et Perseus v1.6.2.357. La recherche dans Maxquant a été effectuée à l’aide de la base de données de séquences de protéines E. coli MG1655 d’UniProtKB (24.04.2019). L’abondance des protéines a été normalisée pour les protéines des grandes et petites sous-unités séparément en décalant le rapport L/M moyen à 1.

Sondage chimique de la structure de l’ARNr

La structure de l’ARNr a été sondée dans les ribosomes 70S isolés à partir de cellules wt ou mutantes. Les ribosomes (10 pmol) ont été placés dans 50 μl de tampon de modification et activés par incubation pendant 5 min à 42 °C. La réaction de modification a été lancée par l’ajout de 2 μl de sulfate de diméthyle (Sigma) dilué à 1:10 dans de l’éthanol. Les échantillons ont été incubés pendant 10 min à 37 °C. Les réactions de modification ont été arrêtées par l’ajout de 50 μl de solution d’arrêt fraîchement préparée (600 mM NaOAc, 1 M β-mercaptoéthanol) et de 300 μl d’éthanol. Les échantillons ont été précipités, remis en suspension dans un tampon (acétate de sodium 300 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0, pH 7,0, SDS 0,5 %) et l’ARN a été isolé par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l’éthanol. Des extensions d’amorces ont été réalisées en utilisant les amorces NA56-NA57.

Analyse du contenu en ARNr mutant

Pour l’analyse de la présence de l’ARNr 23S-cp5S modifié, l’ARN total a été isolé à partir des fractions de gradient de saccharose comme décrit ci-dessus. La teneur en ARNr 23S-cp5S mutant a été évaluée par extension d’amorces en utilisant les amorces NA58 ou NA59. Plus précisément, l’amorce marquée en 5′ (0,5 pmol) a été annelée à 1 μg d’ARN total dans un tampon d’hybridation (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) en l’incubant à 90 °C pendant 1 min puis en la refroidissant pendant 15 min à 42 °C, et prolongée avec 2 U de transcriptase inverse AMV (Roche) pendant 20 min à 42 °C dans un volume de réaction final de 8 µl. Pour l’amorce NA58, la réaction contenait 0,25 mM de ddATP et 0,2 mM de dCTP, dGTP, dTTP. Pour l’amorce NA59, la réaction contenait 0,25 mM de ddCTP et 0,2 mM de dATP, dGTP, dTTP. Les réactions ont été interrompues par l’ajout de 120 μl de tampon d’arrêt (84 mM de NaOAc, 0,8 mM d’EDTA, pH 8,0, 70 % d’EtOH), le refroidissement à -80 °C pendant 15 min et la granulation des acides nucléiques par centrifugation à 15 000 × g pendant 1 h à 4 °C. Les surnageants ont été éliminés, les culots ont été séchés et dissous dans le colorant de chargement formamide. Les produits d’ADNc ont été résolus dans un gel de polyacrylamide dénaturant à 12 % et visualisés par phosphorimagerie.

Traduction in vitro

Les réactions de traduction in vitro ont été réalisées dans le système de traduction sans cellules Δribosome PURExpress (New England Biolabs). Les matrices d’ADN contenant le promoteur de l’ARN polymérase T7, le site de liaison des ribosomes et la séquence codant pour la protéine ont été préparées par PCR. La matrice ermBL a été préparée à l’aide des amorces NA52-NA55. La matrice GFP a été générée à partir du gène sf-gfp du plasmide pY71-sfGFP58 en utilisant les amorces NA31 et NA32. La dihydrofolate réductase (DHFR) a été exprimée à partir de la matrice plasmidique fournie avec le kit PURExpress.

La réaction de traduction pour l’expression de la GFP a été assemblée dans un volume total de 10 μl et contenait 2 μl de la solution A du kit PURExpress, 1.2 μl de mélange de facteurs, 1 μl de mélange d’acides aminés (3 mM chacun), 1 μl d’ARNt (20 μg/ml), 16 U d’inhibiteur de RNase RiboLock (ThermoFisher), 10 ng de matrice GFP et 12 pmol de ribosomes wt ou mutants. Les échantillons ont été placés dans les puits d’une plaque de culture tissulaire à 384 puits à paroi noire et fond plat transparent (BD Biosciences) et recouverts par le couvercle. Les réactions ont été incubées à 37 °C dans un lecteur de microplaques (Tecan), la fluorescence de la GFP étant enregistrée toutes les 10 min à λexc = 488 nm et λem = 520 nm sur une période de 4 h.

L’expression de la DHFR a été suivie de l’incorporation de -L-méthionine dans la protéine de taille complète. La traduction a été effectuée dans des réactions de 10 μl assemblées comme décrit ci-dessus mais complétées par 5 μCi -L-méthionine (1175 Ci/mmol), en utilisant 50 ng de la matrice d’ADN et 6 pmol de ribosomes wt ou mutants. Les réactions ont été incubées à 37 °C. Toutes les 12 min, des aliquotes de 1 μl ont été prélevées, mélangées à 3 μl de colorant de chargement de gel contenant du SDS et conservées sur la glace jusqu’à la fin du déroulement de la réaction. Les produits protéiques ont été analysés par électrophorèse sur gel SDS dans des gels Bis-Tris à 16,5 % (Biorad) en utilisant le tampon de migration NuPAGE MES/SDS (Invitrogen). Les gels ont été colorés, séchés et exposés à un écran de phosphorimage pendant la nuit. Les bandes radioactives ont été visualisées par phosphorimagerie.

Analyse Cryo-EM des ribosomes 70S et des sous-unités 50S

Des grilles Cryo-EM ont été préparées comme suit . Des grilles de cuivre 400 M recouvertes de carbone dentelé et d’une fine couche de carbone de 2 nm (Ted Pella Inc.) ont été soumises à une décharge lumineuse avec un courant de 20 mA à polarité négative pendant 60S dans une unité de décharge lumineuse PELCO easiGlow. Un Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) a été prééquilibré à 4 °C et 95 % d’humidité relative. Une aliquote de ribosomes préalablement congelés au flash a été décongelée et lorsque l’opalescence a été constatée, la solution a été clarifiée dans une micro centrifugeuse (10 minutes à 16 000 × g à 4 °C). La concentration du surnageant clarifié a été dérivée du A260 mesuré à l’aide d’un Nanodrop (ThermoFisher) et les ribosomes ont été dilués à 200 nM dans le tampon LPP . Trois µl de solution de ribosomes 200 nM ont été appliqués sur la grille ; après un délai de 10S, la grille a été épongée pendant 4S puis plongée dans de l’éthane liquide refroidi à l’azote.

Les données ont été recueillies sur un microscope électronique Talos (ThermoFisher) fonctionnant à 200 KV et équipé d’un détecteur d’électrons directs K3 (Gatan Inc.) ciblant 0,5-1,8 μm sous le foyer. La collecte de données a été automatisée avec SerialEM59 en utilisant l’inclinaison du faisceau pour collecter plusieurs films (par exemple, une prise de vue au centre, 6 avec déplacement) à chaque position de la platine60. Les films de super-résolution comportaient un total de 19 images avec 1,5 e-/Å2 par image pour une dose totale de 30 e-/Å2 sur l’échantillon. Au total, 5222 films ont été recueillis en 22 heures. Les films ont été alignés à la volée pendant la collecte des données à l’aide d’IMOD61 pour décompresser les images, appliquer la référence de gain, regrouper les données de superrésolution au pixel physique de 0,87 Å sur l’échantillon et corriger la dérive de l’image.

Les premières étapes de la génération de la carte 3D à partir de la détermination du CTF, du prélèvement de particules sans référence (489 732 particules) et de la création de la pile ont été effectuées dans le cisTEM. L’alignement et le raffinement des particules ont été effectués dans Frealign 9.11 et cisTEM62,63. Pour accélérer le traitement, des piles d’images binées 2×-, 4×- et 8× ont été préparées à l’aide de resample.exe, qui fait partie de la distribution FREALIGN64. Le modèle initial pour l’alignement des particules des cartes 70S était EMD-100365, qui a été sous-échantillonné pour correspondre à la pile d’images binées 8× en utilisant EMAN266. Deux séries de recherche en mode 3 avec une coupure haute résolution de 30 Å puis de 20 Å ont été effectuées en utilisant la pile d’images binées 8×. Ensuite, 7 tours de raffinement en mode 1 ont été exécutés avec la pile 4×, éventuellement non binnée, alors que des coquilles de résolution ont été progressivement ajoutées (limite de 5 Å) et que la résolution a atteint 2,94 Å. Le raffinement par déplacement de faisceau a été utilisé pour améliorer la résolution globale à 2,87 Å.

Vingt tours de classification 3D de maximum de vraisemblance sans masquage et à une résolution de 14 Å ont été utilisés pour séparer rapidement les particules binées 8x en 12 classes de compositions différentes révélant des sous-unités 50S, des ribosomes 70S sans ARNt, ou des ribosomes 70S avec ARNt et le 30S dans une conformation tournée ou non tournée (figure supplémentaire 3a). Les sous-piles de particules 50S (133 490), de particules 70S vides (120 428) ou de particules 70S non tournées et liées à l’ARNt (55 677) ont été créées à l’aide de la pile binnée 1x en utilisant merge_classes.exe, qui fait partie du paquet Frealign, ce qui nécessite des scores de particules de 0 et une occupation minimale de 50 %. Les sous-piles ont ensuite été à nouveau binées à 4x en utilisant resample.exe pour accélérer les étapes de classification ultérieures.

La sous-pile de particules 50S a été séparée en 6 classes avec un masque de focalisation de 55-Å de rayon autour de la portion d’ARNr 5S de l’ARNr hybride 23S-cp5S. Les classes avec uL16 et/ou bL33 faibles ou absentes et les classes différant dans la position de l’ARNr 5S ont été séparées. Les classes ont été reconstruites avec les paramètres originaux d’alignement et d’inclinaison du faisceau à un binning de 1x et l’une de ces classes a été utilisée pour la modélisation structurelle comme détaillé dans la section suivante.

Les particules 70S ont également été étudiées. Le sous-paquet de particules 70S vides (sans ARNt) a été séparé en 12 classes en utilisant le même masque de focalisation de 55-Å. Les classes présentaient des différences dans l’occupation uL16 et/ou bL33 et la position de l’ARNr 5S, comme les classes 50S décrites ci-dessus. Cependant, contrairement aux particules 50S, 3 des 12 classes 70S vides ont révélé un CTP normalement plié.

La classification du sous-ensemble de particules 70S liées à l’ARNt de l’état classique en 12 classes avec le même masque a révélé une occupation presque stœchiométrique de 16 uL, et toutes les particules avaient un CTP normalement plié et une forte densité P-ARNt. En revanche, l’occupation ARNt du site A était faible dans certaines classes avec une densité L33 plus faible. La classification des particules 70S avec un 30S tourné et un état hybride P/E-ARNt en 12 classes a également révélé des occupations variables de uL16 et bL33, et sept classes présentaient un PTC aberrant.

La structure cryo-EM de 3,2 Å du ribosome 70S lié aux ARNt A et P67 a été utilisée comme modèle de départ pour les affinements de structure. Les composants/domaines du ribosome ont été ajustés dans des cartes à l’aide de Chimera68. Ici, le 50S, le pédoncule L1, le pédoncule L11, le corps et la tête du 30S, et les ARNt ont été ajustés indépendamment. La modélisation de l’ARNr 5S et les ajustements du CTP et du centre de décodage ont été effectués à l’aide de PyMOL69. Les modèles structuraux ont été affinés à l’aide d’un affinement par recuit simulé en espace réel utilisant RS Ref 70,71 par rapport aux cartes correspondantes. Les paramètres d’affinement, tels que la pondération relative des contraintes stéréochimiques et le terme d’énergie expérimentale, ont été optimisés pour produire la stéréochimie optimale de la structure, le coefficient de corrélation dans l’espace réel et le facteur R, qui rend compte de l’ajustement du modèle à la carte72. Des contraintes de structure secondaire, comprenant des contraintes de liaison hydrogène pour les protéines ribosomales et des contraintes d’appariement de base pour les molécules d’ARN, ont été utilisées comme décrit73. Les structures ont ensuite été affinées à l’aide de phenix.real_space_refine74, suivi d’une série d’affinements dans RSRef en appliquant des restrictions harmoniques pour préserver la géométrie des protéines70,71. Phenix a été utilisé pour affiner les facteurs B des modèles par rapport à leurs cartes respectives sans filtrage des facteurs B74. Les modèles structuraux résultants ont de bons paramètres stéréochimiques, caractérisés par un faible écart par rapport aux longueurs et angles de liaison idéaux, et sont en accord étroit avec les cartes correspondantes, comme l’indiquent les coefficients de corrélation élevés et les faibles facteurs R dans l’espace réel (tableau supplémentaire 2). Les figures ont été préparées dans PyMOL69.

Résumé du rapport

Des informations supplémentaires sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport de Nature Research lié à cet article.